[发明专利]绵羊重组朊蛋白、其单克隆抗体及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别地，涉及绵羊重组朊蛋白PrP^C51-216、其单克隆抗体及应用。

背景技术

痒病(scrapie)是绵羊的一种缓慢发展的致死性中枢神经系统退行性疾病，病羊具有中枢神经系统变性、空泡化、星形胶质细胞增生等特点，表现为共济失调、痉挛、麻痹、衰弱和严重的皮肤搔痒，病畜100％死亡，人们称之为羊痒病。羊群感染后，很难清除病原体。羊痒病早在1732年在英格兰发现，1920-1950年曾在英国严重流行，现已广泛分布于欧洲、亚洲和美洲多数养羊业发达国家。更为严重的是，1986年发生于英国的疯牛病，其病原因子后来被证实与羊痒病的病原因子一致，而人类变异性克雅氏病(vCJD)是由食入感染了BSE的食物而传播。因此，羊痒病发生或流行对于人类社会公共卫生造成严重威胁，目前我国尚未见到发生羊痒病的报道，为了防患于未然，国家投入大量资金和力量预防和控制这类疾病的发生，目前该病的诊断主要依据病理学检查及用免疫组化、免疫印迹试验(WesternBlot)检测神经组织中的病原因子PrP^Sc，这些方法大多需要高度灵敏、特异的抗体。由于单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强、成分均一的优点，已成为羊痒病检测技术中的核心试剂。国外有商品化单克隆抗体出售，但未见有使用去除N端信号肽、C端GPI锚定位点的核心片段绵羊PrP^C51-216重组蛋白制作的单克隆抗体。

目前我国羊痒病的检测主要在OIE的指导下，在专业实验室进行，包括病理组织学检测、免疫组织化学检测和Western Blot检测，其中免疫组织化学检测和Western Blot检测是检测羊痒病的“金标准”，这两种方法的关键技术或核心试剂就是单克隆抗体，国内尚没有商品化的产品。国际上商品化的羊痒病检测试剂盒，每头份的检测费用约为0.04万，如果用自主研制的试剂盒代替进口产品，我国羊痒病的监测工作每年仅试剂费用就可节约百余万，并打破国际在疯牛病等重大外来动物疫病检测技术方面的技术壁垒，从而保障我国畜牧业的健康发展以及人民的公共卫生。

发明内容

本发明的目的是提供一种绵羊重组朊蛋白PrP^C51-216及其体外制备方法。

本发明再一个目的是提供绵羊重组朊蛋白PrP^C51-216。

本发明另一个目的是提供用于制备绵羊重组朊蛋白PrP^C51-216的基因工程菌。

本发明还有一个目的是提供采用绵羊重组朊蛋白PrP^C51-216制备的单克隆抗体。

为实现上述目的，本发明克隆和表达了绵羊朊蛋白PrP^C51-216，这段蛋白去除N端的信号肽，C端的GPI锚定位点，包含蛋白酶K抗性片段，更有利于制备单克隆抗体。

本发明提供绵羊重组朊蛋白PrP^C51-216，该蛋白具有序列表SEQNO.2所示的氨基酸序列，或者是该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。该蛋白分子大小为27kD。

本发明还提供编码所述绵羊重组朊蛋白PrP^C51-216的基因，优选地，该基因为PRNP，其核苷酸序列如序列表SEQ NO.1所示。

本发明进一步提供所述绵羊重组朊蛋白PrP^C51-216的制备方法，包括如下步骤：

利用所述PRNP基因构建表达载体，转化宿主菌，经过筛选得到阳性转化体；阳性转化体经发酵培养后，破碎菌体，分离纯化PrP^C成熟蛋白，经复性，得到活性蛋白PrP^C51-216。

本发明还提供由所述PrP^C51-216作为免疫原制备得到的抗PrP^C51-216抗体。优选地其为单克隆抗体。

上述抗体可由下述步骤得到：采用所述绵羊重组朊蛋白PrP^C51-216，免疫Balb/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，经融合筛选出杂交瘤细胞株，该细胞株能稳定分泌针对绵羊朊蛋白PrP^C 51-216特异单克隆抗体。

本发明还提供含有上述抗体的诊断试剂。

具体地说，本发明包括如下步骤：

1、基因工程菌的构建