[发明专利]一种小麦矮腥黑粉菌的特异基因序列、特异性SCAR标记及PCR检测方法

说明书

技术领域：

本发明属生物技术领域，涉及一种小麦矮腥黑粉菌的特异性基因片段、特异性SCAR标记及PCR检测方法。

技术背景

小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn，简称TCK)引起的小麦矮腥黑穗病是一种重要的国际检疫性病害，对小麦生产具有毁灭性危害，也是我国外来生物入侵研究的主要物种之一(王圆.小麦矮腥黑穗病菌[M].中国进境植物检疫有害生物选编，中华人民共和国动植物检疫局和农业部植物检疫实验所编，北京：中国农业出版社，1997，95～98)。在小麦矮腥黑穗病流行年份引起的产量损失一般为20～50％，严重时可达75～90％，甚至绝产。病菌抗逆性极强，其冬孢子在土中可存活3～7年，包裹在菌瘿中的冬孢子甚至可保持活力长达10年以上。此病害一旦发生，很难防治或根除，所以国际上有15个国家将其列为检疫对象加以防范。我国从20世纪60年代开始一直将此病害列为一类对外检疫对象。在腥黑粉菌中，TCK与其近缘种小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌等在形态学上极为相似，难于区别。

传统的病害诊断、检测方法主要是依据病原形态学、生理学和生物化学的特性，不但过程繁琐、时间周期长，而且准确性差、精度不高。因此，利用分子生物学手段快速、准确地鉴别小麦矮腥黑粉菌具有重要的理论意义和实用价值。1996年Ferreira等(Ferreira M.A.，TooleyP.W.，Hatziloukas E.etc.Isolation of a species specific mitochondrial DNA sequence foridentification of Tilletia indica，the Karnal bunt of wheat fungus[J].Application EnvironmentMicrobiology，1996，62：87～93)首次将PCR技术引进到印度腥黑穗病(Tilletia indicaMitra)的鉴定中来，他们选择了印度腥黑粉菌线粒体DNA的一个2.3kb的EcoR I片段进行了克隆和测序，设计的特异性引物Ti1/Ti4从25种腥黑穗病菌菌株中鉴定出了印腥。另外，Smith等(Smith O.P.，Peterson G.L.Beck R.J.etc.Development of a PCR-based method foridentification of Tilletia indica，causal agent of karnal bunt of wheat[J].Phytopathology，1996，86：115～122)通过克隆印度腥黑粉菌线粒体DNA的Dra I片段，进行了序列分析，设计了两套寡核苷酸引物对Ti17/M1和Ti17/M2，能分别从印度腥黑粉菌中扩增出大小为825bp和118bp特异性片段，也实现了对印度腥黑穗病的检测鉴定工作。2000年Frederic等(FrederickR.D.，Snyder K.E.，Tooley P.W. Identification and Differentiation of Tilletia indica and T.walkeri using the Polymerase Chain Reaction[J].Phytopathology，2000，90：951-960.)根据线粒体的差异设计了5对针对印度腥黑粉菌的特异性引物和3对针对黑麦草腥黑粉菌的特异性引物，分别能将印度腥黑粉菌菌株和黑麦草腥粉菌病菌株从其近缘属种中鉴别出来。张竞宇等(张竞宇，张正光，郑小波，等.小麦印度腥黑穗病菌的分子检测[J].高技术通讯，2004，1：31～36)利用核糖体ITS序列上的差异在Tilletia属20个种中设计了一对特异性引物T1/T2，能将T.indica和T.walkeri从其它种中区分开来，而后又根据T.indica和T.walkeri线粒体之间的差异设计了一对特异性引物M1/M2，可以将二者区分开来，为了使反应更为灵敏，建立了套式PCR技术，以便于提供更简单的鉴定方法。梁宏等(梁宏，彭友良，张国珍，等.腥黑粉菌属3种检疫性真菌rDNA 2IGS区的扩增及其序列分析[J].植物病理学报，2006，36(5)：407-412)依据核糖体的IGS1区特性，设计了一对特异性引物，可以将小麦光腥黑粉菌菌株从其近缘属种中鉴别出来。2004年高强(高强.小麦矮腥黑穗病的分子检测[D].长沙，湖南农业大学，2004)利用RAPD技术找到了一条可以将小麦网腥黑粉菌菌株和小麦矮腥黑粉菌菌株区别于其它黑粉菌株的条带，但是很遗憾在矮腥黑粉菌和网腥黑粉菌之间没有找到有差异的条带，没能将二者分开。2006年周业琴，刘素萍等(周业琴，刘素萍，周国梁，等.水稻腥黑粉病菌的单孢检测[J]。植物检疫，2006，20：38～41)应用核糖体ITS序列的通用引物Til1/Til4和两对特异性引物(Hor2/Hor9；Hm1/Hm5)结合建立了套式PCR技术，可以将水稻腥黑粉菌标定出来。本实验室陈万权、刘太国、刘建华利用AFLP技术，找到了小麦矮腥黑粉菌的特异性片段，能将小麦矮腥黑粉菌从其近缘属种中区分开来，该技术已经获得国家发明专利，专利号为：200510080073.7，但未报道其检测的灵敏度，尚未在海关检疫中应用。