[发明专利]流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种rRT-PCR检测技术，尤其涉及一种流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法。

背景技术

流感病毒基因组由8条负链RNA节段构成。根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同分为A型、B型、C型。A型流感病毒根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为16个HA亚型和9个NA亚型；B型和C型流感病毒不分亚型。A型常引起世界性大流行；B型、C型则以局部暴发和散发流行为特征。

2009年3月，墨西哥和美国先后发现了甲型H1N1流感病毒感染病例，至2009年5月21日，全球已经有42个国家出现甲型H1N1流感确诊病例，确诊病例超过1万，感染人数呈不断上升趋势。目前的数据显示，该病毒已经具备了人际传播的能力，人群对该病毒的免疫低下，因此病毒在人际之间的传播能力较普通流感病毒强。

甲型H1N1流感潜伏期一般1至7天，早期症状与普通流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。部分患者病情来势凶猛、突然高热、体温超过39℃，甚至继发严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、休克及Reye综合征、呼吸衰竭及多器官损伤，最后导致死亡。甲型流感H1N1亚型病毒的基因核酸序列与季节性流感病毒H1N1接近，病原的诊断需要采用较为复杂和繁琐的基因序列测定，难以在普通实验室进行。

现有技术中，采用的流感病毒检测方法为鸡胚病毒分离培养方法，灵敏度高。

上述现有技术至少存在以下缺点：

操作费时、需3周时间，而且对实验室的要求也比较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、应用方便的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，包括以下一种或多种引物和探针：

甲型流感病毒特异性引物和探针、两组新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针、新甲型流感病毒特异性引物和探针；

所述甲型流感病毒特异性引物和探针针对甲型流感病毒M基因相对保守区；

所述两组新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针针对新甲型H1N1流感病毒HA基因相对保守区；

所述新甲型流感病毒特异性引物和探针针对新甲型流感病毒NP基因相对保守区。

本发明的应用上述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测流感病毒的方法，包括步骤：

首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA；

然后，利用一步法rRT-PCR试剂盒加入所述引物和探针进行核酸扩增；

之后，根据Ct值判断rRT-PCR检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法，由于包括针对甲型流感病毒M基因、新甲型H1N1流感病毒HA基因、新甲型流感病毒NP基因相对保守区引物和探针，可以通过rRT-PCR法检测流感病毒，操作简单、应用方便。

具体实施方式

本发明的流感病毒rRT-PCR(real-time RT-PCR)检测引物和探针，其较佳的具体实施方式是，包括以下一种或多种引物和探针：

甲型流感病毒特异性引物和探针、两组新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针、新甲型流感病毒特异性引物和探针；

所述甲型流感病毒特异性引物和探针针对甲型流感病毒M基因相对保守区；

所述两组新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针针对新甲型H1N1流感病毒HA基因相对保守区；

所述新甲型流感病毒特异性引物和探针针对新甲型流感病毒NP基因相对保守区。

所述引物和探针可以包括长度为19～28bp的寡核苷酸片段；

其中，针对M基因和HA基因的探针与目的基因负链的碱基序列一致，针对NP基因的探针与目的基因正链的碱基序列一致。

所述甲型流感病毒特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列：

引物序列：5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；5’-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3’；

探针序列：5’FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-TAMARA3’；

第一组所述新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列：