[发明专利]一种抗人α1酸性糖蛋白的单克隆抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫化学、蛋白质化学和细胞生物学领域。具体而言，本发明涉及一种可以产生特异针对人α1酸性糖蛋白(AGP，Serumα1-acidglycoprotein)的单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其制备方法。该杂交瘤制备的单克隆抗体可以应用于疾病的诊断或者相关领域。

技术背景

蛋白质的翻译后修饰状态与蛋白质功能密切相关，其中糖蛋白发挥了多种重要的生物功用，如细胞膜上的糖蛋白参与胚胎发育、细胞移动、免疫反应以及细胞分裂等过程。另外，大部分血浆蛋白都具有不同程度的糖基化修饰。值得注意的是，现在已知的作为各种疾病检测标记物的蛋白质都是糖蛋白，如PSA，AFP，CA125，CA153和HER-2等。多年来，关于对血浆中的生物标记物的检测的研究取得了一定的进展。其中最重要的方法就是生产针对这些蛋白的抗体，通过ELISA的方法实现对这些蛋白的检测和定量。该方法的关键即是获得特异性好、灵敏度高的抗体。目前，传统的生产抗体的方法已经相当成熟且在大多数情况下非常有效，但是对于血浆中的这些糖蛋白抗体的生产，传统的方法往往存在一定的不足，这是由于具有天然糖基化修饰的蛋白难以获得，而且糖蛋白的抗原性往往不强。原核表达的蛋白，由于不具有糖基化修饰，籍此产生的抗体往往不能很好地识别人血液中的糖蛋白。糖蛋白抗体的生产通常可以通过富集和纯化生物体内的天然糖蛋白作为抗原，采用传统的抗体生产方法进行抗体制备。但是这种方法对于那些在生物体内含量较低，或者难于纯化的糖蛋白并不合适。而且更重要的是，在一系列体外操作过程中，对糖蛋白的各种性质是否造成不同程度的影响，也是不得而知的。因此为了克服以上困难，一些科学家已经研发出新的抗体制备方法以获得特异针对糖蛋白的抗体。McKenzie采用小鼠腹腔注射在其细胞膜上稳定表达外源糖蛋白Neu的肿瘤细胞作为免疫抗原的方法，刺激机体产生并筛选出针对该蛋白的单克隆抗体。在该方法中，将Neu基因导入到NIH3T3细胞中，使其在细胞膜上稳定表达。细胞通过腹腔注射入小鼠后，该蛋白的细胞外部分即可作为抗原刺激机体产生抗体。该方法克服了膜上糖蛋白难于富集纯化的困难，而且实验结果也表明，这种方法生产的抗体比依靠合成Neu蛋白上的肽段作为抗原生产出的抗体具有更好的特异性，可以区分与其相似性极高的蛋白。Atabai也通过类似的方法将稳定表达MFGE8蛋白的人的肿瘤细胞注射到兔子体内，通过筛选获得特异性单克隆抗体。Suzuki等将heparin的糖链连接到载体蛋白KLH上作为抗原，采用传统方法注射到小鼠体内，筛选出可特异识别该糖链的单克隆抗体。但是上述研究并没有能够提供一种应用性广泛的方法，而且实验操作比较复杂。

本发明人以人AGP为例，试图建立一套可生产特异识别糖基化蛋白的抗体的方案，由此生产的单克隆抗体可基本上克服糖蛋白抗原性低下和糖蛋白抗体特异性差的缺陷。将外源的糖蛋白基因通过逆转录病毒载体导入到小鼠黑色素瘤细胞B16中，经过筛选获得稳定表达株。该表达株可以持续地将外源糖蛋白分泌到细胞外。将稳定细胞株和佐剂混合后经皮下注射到C57BL/6J小鼠体内，随着细胞的不断增殖和生长，外源糖蛋白被持续分泌到小鼠体内作为抗原刺激机体产生抗体。将血清呈阳性反应的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合后，通过多次筛选，可以得到可特异识别外源糖蛋白的单克隆抗体。该方法与传统的生产糖蛋白单克隆抗体的方法相比具有明显的优势：在此过程中，细胞表达分泌的蛋白具有正确的糖基化修饰，不需对它们进行富集，而且这些抗原是持续性的分泌到小鼠体内，不断刺激机体的免疫系统，这样既解决了糖蛋白富集的难题，又解决了糖蛋白抗原性低的问题。我们采用该方法成功地生产了AGP的单克隆抗体，这些抗体可以特异性的识别糖基化修饰的AGP，而对非糖基化的AGP几乎不具有识别能力。

发明内容

一)本发明涉及一种能够特异性识别血浆糖蛋白AGP的鼠源单克隆抗体BPI-AGP，以及该单克隆抗体在疾病检测中的应用。该单克隆抗体BPI-AGP的亚类为IgG1型，而且可以特异性的识别糖基化修饰的AGP，而对非糖基化的AGP几乎不具有识别能力。

二)本发明涉及一种能够分泌特异性识别AGP单克隆抗体的杂交瘤细胞系。该杂交瘤细胞系产生的抗AGP单克隆抗体BPI-AGP用于对血液中糖蛋白的表达水平的检测。如用于检测疾病状态下患者血液中AGP的丰度改变。