[发明专利]一种检测动物病原微生物的方法及其专用蛋白芯片

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，特别是涉及一种动物病原微生物检测方法及其专用蛋白芯片。

背景技术

动物与人类的生活、生产和科学研究工作密切相关，对动物所携带的微生物进行检测，保证动物的质量，对保障人类健康，促进经济发展和确保动物实验准确性具有重要的意义。

传统的，也是目前应用最广的微生物检测方法是通过分离培养对微生物进行菌落、个体形态，生理生化鉴定。这种方法工作量大，耗时长，而且对实验操作者要求比较高。

随着现代科学发展，一些新技术应用于微生物检测。基于分子生物学的聚合酶链式反应(PCR)检测技术与DNA芯片技术实现了微生物的快速检测，但是有比较严重的交叉反应现象，且取材需要是正在被感染的组织。基于免疫学的血清凝集和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测法，取材简单，但是由于大多数微生物之间存在某些共同的抗原决定簇，所以交叉反应非常严重，目前也只能作为微生物检测的辅助手段。蛋白质芯片技术是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的大量蛋白有规律的固定其上(如抗原等)，根据这些分子的特性捕获能与之特异性结合的待测蛋白(如存在于血清中的抗体等)，然后用激光扫描系统或电感耦合器件(CCD)获取数据图像，最后用专门的计算机软件进行图像分析，结果定量和解释。由于蛋白纯化较困难，且操作过程中极易失活，所以蛋白芯片技术的发展明显滞后于基因芯片，目前用于微生物检测的蛋白芯片有交叉反应现象，检测效果不佳。

发明内容

鉴于以上问题，本发明的主要目的是提供一种动物病原微生物的检测方法及其专用蛋白芯片，该种方法提高了检测效率，同时具有很好的检测特异性。

为了达到以上目的，本发明提供的该种动物病原微生物的检测方法，其主要包括以下步骤：

a.制备蛋白芯片，通过实验挑选多种病原微生物的多组不同的特异性抗原固定到合适的修饰过的载体上，如聚赖氨酸修饰、氨基修饰、醛基修饰、环氧基修饰及三维立体修饰等，同时将不同抗原按预先设定的矩阵规则排列；

b.检测，将待检动物的血清与上述蛋白芯片反应，再与标记的二级抗体杂交，通过适当的检测手段检测杂交阳性信号，并通过扫描分析获取动物血清与芯片的杂交结果，感染不同病原微生物的动物血清，反应后在蛋白芯片上会呈现不同的阳性信号组合模式，这样就可以确定被检动物是否正在感染或感染过蛋白芯片上标记的病原微生物。

上述步骤a中，对每一种病原微生物通过多项实验选择3组或3组以上不同的具有一定特异性的蛋白抗原，并同时把这些抗原都固定在同一张芯片上，这样有效的避免了细菌间因有某些共同的抗原决定簇而产生的交叉反应问题，提高了检测的特异性。

上述步骤a中，所述挑选病原微生物的特异性抗原的实验方法具体可以为：将培养好的病原微生物用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)洗涤两次，洗去培养基；之后再用磷酸盐缓冲液重悬，通过机械法、超声处理法或溶菌酶法将病原微生物裂解，离心取上清液；将上清液走SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜后与抗不同细菌的抗血清杂交，通过对杂交结果的分析，初步选择几种具有一定特异性的抗原；接着再通过凝胶过滤层析、离子交换层析及SDS-PAGE胶回收电泳等方法提取上清液中的不同蛋白；对提取的蛋白进行SDS-PAGE结合蛋白印迹(western blot)或酶联免疫吸附试验(ELISA)分析，最终对每一种病原微生物确定3组及3组以上的不同的具有一定特异性的抗原。

本发明还提供的一种用于上述动物病原微生物检测方法的专用蛋白芯片，该种蛋白芯片通过将多种微生物的多组不同的特异性抗原固定到合适的修饰过的载体上，不同抗原按预先设定的矩阵规则排列；

所述载体的修饰可通过聚赖氨酸修饰、氨基修饰、醛基修饰、环氧基修饰、及三维立体修饰等方式；

针对每一种病原微生物，优选通过实验选择3组或3组以上不同的具有一定特异性的蛋白抗原；

本发明提供的该种蛋白芯片具有很大的容量，本发明对每种微生物选定多种不同的特异性抗原，并把多种病原微生物的预先选定的抗原固定在同一张芯片上，可以通过一次反应检测多种微生物，提高了检测效率，节约了检测时间和检测成本。

本发明通过将多种病原微生物抗原固定在同一张芯片上，每一种病原微生物选择多组特异性抗原，与待检动物血清杂交后，通过不同的阳性信号组合模式来判定检测结果。这样既可以同时检测多种病原微生物，提高了检测效率，又避免了由于某种共同抗原决定簇而导致的普通血清学检测中的交叉反应问题，具有很好的检测特异性，因此，本发明在动物病原微生物检测方面具有良好的应用前景。