[发明专利]DKK-1特异性siRNA及其在类风湿关节炎治疗中的应用

说明书

技术领域

本研究涉及DKK-1在类风湿关节炎患者纤维样滑膜细胞中的表达水平、靶向DKK-1的 小干扰RNA(siRNA)对细胞功能的抑制作用，以及作用途径。

背景技术

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性致残性关节炎为特征的自身免疫 性疾病，约占总人口的0.5-1％，也是我国最主要的引起青壮年劳动力丧失的原因之一。其病 理特点是关节滑膜组织中大量炎症细胞聚集增生，滑膜细胞和血管增生，增生的滑膜组织向 关节软骨面生长并侵蚀关节软骨并分泌多种炎性因子和酶类，引起关节软骨及骨的破坏，最 后关节畸形强直、功能障碍，导致残疾。目前RA的发病机制并不明确，限制了治疗手段的 发展。事实上，越来越多的证据表明具有转化特性的关节滑膜细胞参与关节软骨和骨破坏是 类风湿关节炎的特征性表现。

滑膜细胞主要分为A型巨噬细胞样滑膜细胞(Macrophage like synovial cell，MLS)以及B 型成纤维样滑膜细胞(Fibroblast like synovial cell，FLS)。在RA患者关节中滑膜细胞大量增生， 分泌细胞因子，不仅为滑膜中其他炎症细胞的生存提供“微环境”，而且具有转化特性的滑膜 细胞还具有参与关节软骨和骨破坏的RA特征表现，特别是FLS。

Dickkopf-1(DKK-1)是Wnt信号通路的内源性抑制因子，Wnt/DKK-1它不仅参与了生物 体的正常发育，在疾病的发生中也起着极为重要的作用，为我们了解疾病的发生机制提供了 新的线索，试图寻找到能够抑制RA滑膜细胞骨破坏和炎性因子分泌的方法。

本研究在观察RA患者FLSs中DKK-1表达情况的基础上，进一步探索了抑制DKK-1的 表达对RA滑膜成纤维细胞功能的影响，旨在寻找靶向DKK-1的siRNA潜在的治疗价值。

发明内容

为了深入了解DKK-1在RA发病中的调控作用，我们研究了下调细胞DKK-1的表达对 RA患者FLS增殖、炎性因子分泌及细胞侵袭能力的影响。实验分两组进行，一组为肿瘤坏 死因子-α(TNF-α)活化组，一组为无TNF-α活化组，脂质体转染化学合成的siRNA(序 列为正义链5′-GCUCUCAUGGACUAGAAAUDTDT-3′，反义链5′ -AUUUCUAGUCCAUGAGAGCDTDT-3′)，并以无关序列小RNA为阴性对照。48小时后检 测FLS的增殖情况，及细胞上清IL-6、IL-8、MMP2及MMP9的水平。我们发现TNF-α活 化组FLSs增殖及细胞因子分泌水平明显增高；而下调DKK-1对两组FLS的增殖、炎性细胞 因子的分泌和侵袭能力均有明显的抑制作用。这表明，TNF-α在RA患者FLS的活化过程中 起着重要作用，而DKK-1对RA患者过度活化的FLS具有促进作用，这对于RA的免疫治疗 具有重要意义。

附图说明

图1.siRNA的筛选及鉴定：6对靶向DKK-1的siRNA转染RA患者FLSs后，DKK-1表达水平显著 降低，结果0.2314±0.07、0.106±0.04、0.413±0.103、0.156±0.08、0.187±0.06、0.13 ±0.05均明显低于阴性对照1，差异具有统计学意义见图1。

图2.siRNA的筛选及鉴定：6对靶向DKK-1的siRNA转染RA患者FLSs后，ELISA法检测细胞上 清中DKK-1表达水平，结果1.8076±0.467，1.739±0.464，3.27±0.471，2.494±0.478， 1.946±0.432和1.956±0.289(ng/ml)均明显低于阴性对照6.926±0.52ng/ml差异具有统 计学意义(p＜0.01)。

图3.3H掺入法检测DKK-1对RA-FLS增殖的影响。在无TNF-α组(A)及TNF-a活化组(B)， 转染siRNA 48小时后，FLS cpm值分别为3009.667±812.98和5028.35±544.75均明显 低于阴性对照8412.3±866.91，12648.60±1377，P均＜0.01)。