[发明专利]酶免法测定纸片奶样生殖激素浓度的方法

权利要求书

1.酶免法测定纸片奶样生殖激素浓度的方法，包括：

1）奶样采集：用相同大小的滤纸片采集尾乳，纸片应饱和浸润奶样，纸片烘干置 于干燥器内；

2）滤纸片奶样制样：将干燥后的奶样纸片称重w₁，剪碎置于抽提管，加入二氯甲 烷充分浸泡，震荡30min，将抽提液转移到玻璃器皿内，置于干燥箱内40℃干燥脱水， 同时收集碎纸片干燥称重w₂，向抽提液标本中加500μl含有质量体积比为0.1%BSA、 浓度为0.01M、pH7.0的磷酸盐缓冲液润洗，制成ELISA工作液；

3）包被抗体：用包被缓冲液将抗孕酮或抗雌二醇的抗体按照产品说明书稀释成包 被工作液，在已编号的载体板各孔内，第1列第A、B、C排的3孔作为对照组除外， 加抗孕酮或抗雌二醇IgG稀释液100μl，加盖，4℃冰箱中静置24～48小时，包被缓冲液 按200ml配制：Na₂CO₃0.318g、NaHCO₃0.586g、H₂O200ml；

4）洗涤：取出反应板，甩掉包被缓冲液，用洗涤液洗涤3次，吸水纸吸干，洗涤 液按1000ml配制：500μl吐温20、H₂O1000ml；

5）加样：在包被板A排第2～12列和F排第1～12列各孔内依次加稀释后的待测样 本100μl；B和C排重复A排加样，G和H排重复F排加样；D和E排按照浓度低至高 的顺序依次加标准抗原，每个梯度重复3次；

6）加酶标物：加样后，将板置于4℃冰箱中，配制酶标物，取出载体板，在各孔内 加酶标物100μl，置37℃培养箱中反应2小时；

7）洗涤：取出反应板，甩掉反应板的反应液，用洗涤液洗涤3次，吸水纸吸干；

8）加底物液：配制底物液，在各孔内加底物液200μl，室温避光反应30min，此时 反应液呈蓝色；底物液按20.25ml配制：TMB250μl、过氧化脲2ml、H₂O18ml；

9）加终止液：各孔加终止液50μl，此时反应液呈黄色，终止液按6ml配制：浓硫 酸∶水=1∶9，浓硫酸600μl、水5.4ml；

10）读取OD值：用酶标仪在450nm波长处读取各孔的光密度值；

11）OD值到浓度的换算：

（1）以标准孕酮或雌二醇的浓度为横座标，结合率为纵座标，绘制标准曲线，待 测样本的结合率在标准曲线横座标上所对应的值乘以样本稀释倍数，即可求得待测样本 的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

（2）或者将标准曲线直线化：设孕酮或雌二醇浓度为X，结合率为y，可得回归方 程y=A+Blogx，即可求得待测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

（3）或者直接使用curxpt软件建立标准曲线，进行结合率与浓度的换算；即得待 测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

12）激素浓度定量计算：

（1）pg激素/片奶样：

（2）或者ng激素/ml奶样：根据抽提前后纸片重量差Δw=w₁-w₂，牛奶干物 质含量取12.5%，比重取1.02，换算得到生殖激素质量体积浓度：