[发明专利]重组鼠骨髓瘤细胞及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组鼠骨髓瘤细胞及其应用。

背景技术

哺乳动物细胞大规模发酵是确保抗体药物能够批量生产供应临床使用的基础，也是现代生物制药领域中最为关键的技术。美国食品药品管理局在2000年1月-2004年12月批准上市的31种生物技术药物中，约70％为哺乳动物细胞表达的重组蛋白。目前国际上主要用CHO、SP2/0、NSO等三种细胞系生产重组蛋白治疗药物。例如治疗淋巴瘤的Rituximab，治疗类风湿性关节炎的Infliximab，和预防急性器官排斥的Daclizumab分别是用CHO，NSO和SP2/0表达的。

目前我国批准上市的由哺乳动物细胞表达得到的药物产品很少，只有促红细胞生成素(EPO)、CHO基因工程乙肝疫苗、以及最近批准上市的治疗性抗体药物益赛普(有效成分相当于美国食品药品管理局批准的Enbrel)和泰欣生(有效成分相当于美国食品药品管理局批准的Erbitux)等少数几种生物技术药物。主要是由于哺乳动物细胞表达的技术复杂和控制要求高，而这已成为我国生物技术药物产业化最难跨越的“门槛”。目前研发主要集中在CHO细胞上，而关于NSO细胞的研究很少。NSO细胞是小鼠浆细胞瘤细胞，与CHO细胞最大的区别在于NSO细胞不需要基因扩增的过程就可以得到高表达细胞株。这一特点不但可以节约6个月的工程细胞株开发时间，而且可以大大简化药物申报时对细胞株稳定性的鉴定工作。NSO细胞是悬浮培养的细胞，不需要从贴壁到悬浮的驯化过程，这也是其相对于CHO细胞的优势之一。因此，加强对NSO细胞的研究，从而实现用NSO细胞株大规模生产药物产品，将会对生物技术药物产业化产生重要意义。

在细胞培养过程中，L-谷氨酰胺是很重要的，脱掉氨基后，可作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成与核酸代谢。由于NSO细胞中谷氨酰胺合成酶的活性低，所以需要在培养基中提供外源谷氨酰胺才能生长。但L-谷氨酰胺在溶液中不稳定，在高温下会分解成吡咯烷酮和羧酸，使得培养基的pH值难以控制，而培养基酸碱度的微小变化都将引起细胞存活率的下降；另外还有一些毒降解产物如NH⁴⁺会不可逆转地损坏细胞壁。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种谷氨酰胺合成酶编码基因的表达盒。

本发明所提供的谷氨酰胺合成酶编码基因的表达盒，由上游至下游依次为序列表中序列1所示的CMV启动子序列、谷氨酰胺合成酶的编码基因序列、序列表中序列2所示的SV40增强子序列。

上述表达盒中，所述谷氨酰胺合成酶的编码基因的核苷酸序列具体可如序列表中序列3所示。

本发明的另一个目的是提供一种能在无谷氨酰胺培养基中生长的重组鼠骨髓瘤细胞。

本发明所提供的重组鼠骨髓瘤细胞，是将上述任一所述表达盒导入鼠骨髓瘤细胞中得到的。

所述鼠骨髓瘤细胞具体可为鼠骨髓瘤细胞NSO。

所述重组鼠骨髓瘤细胞具体可为鼠骨髓瘤细胞NSO NSO-GS1，其保藏号为CGMCCNo.2128。该细胞株已于2007年08月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2128。

本发明的另一个目的是提供一种培养上述能在无谷氨酰胺培养基中生长的重组鼠骨髓瘤细胞的方法。

本发明所提供的培养能在无谷氨酰胺培养基中生长的重组鼠骨髓瘤细胞的方法，是将所述重组鼠骨髓瘤细胞接种于含8-10％(体积百分含量)血清、pH值为7.4-7.6的、无谷氨酰胺的RPMI1640培养基，在37±0.5℃条件下培养。

能在无谷氨酰胺培养基中生长的重组鼠骨髓瘤细胞在生产外源蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的能在无谷氨酰胺培养基中生长的重组鼠骨髓瘤细胞，在无谷氨酰胺培养基中的培养效率高，细胞密度可达10⁶个/ml，培养得到的NSO细胞能表达目的外源蛋白，且表达能力强，可达12-18pg/cell/24h。用本发明的能在无谷氨酰胺培养基中生长的重组鼠骨髓瘤细胞表达外源蛋白，既能保证细胞培养效率和表达效率，又可减轻谷氨酰胺的分解给细胞带来的伤害，进而提高生物制品成品率和利润率。同时本发明的细胞制备方法，又节省了成本。这种能在无谷氨酰胺培养基中生长的重组鼠骨髓瘤细胞及其制备方法在生物制药领域将会有广阔的应用前景。

附图说明

图1为载体PCI-CSP的图谱。

图2为载体PCI-GS-CSP的图谱。

图3为载体PCI-gpt的图谱。