[发明专利]DNA分子片段与载体连接的方法及在大容量抗体库构建中的应用有效
| 申请号： | 200910091261.8 | 申请日： | 2009-08-14 |
| 公开（公告）号： | CN101619323A | 公开（公告）日： | 2010-01-06 |
| 发明（设计）人： | 孙志伟;王双;俞炜源;杜威世;余云舟 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66;C40B40/08 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 | 代理人： | 王朋飞 |
| 地址： | 100071*** | 国省代码： | 北京;11 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | dna 分子 片段 载体 连接 方法 容量 抗体 构建 中的 应用 | ||
1.一种DNA分子片段与载体连接的方法，其特征在于，载体上包括至少三个不同的酶切位点E1、E2和E3，其中E2位于E1和E3之间；待连接的DNA分子片段至少包括酶切位点E1和E3，先对载体上酶切位点E1和E2进行酶切和去磷酸化；再对DNA分子片段的酶切位点E1进行第一步酶切和连接，得到DNA分子片段和载体的线性连接产物，然后回收正确大小的连接产物；最后对连接产物的酶切位点E3进行第二步酶切和连接，得到自连接的环状连接产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切位点E1选自Sfi I、Not I、EcoR I、Hind III、BamH I、AlwN I、Bsa I、BseY I、Dra III或Ear I酶切位点中的一种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切位点E2选自Sfi I、Not I、EcoR I、Hind III、BamH I、AlwN I、Bsa I、BseY I、Dra III或Ear I酶切位点中的一种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切位点E3选自Sfi I、Not I、EcoR I、Hind III、BamH I、AlwN I、Bsa I、BseY I、Dra III或Ear I酶切位点中的一种。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶切位点E3为具有非反向回文结构的限制性内切酶位点，选自Sfi I、AlwN I、Bsa I、BseY I、Dra III或Ear I中的一种。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，第一步连接体系中DNA的浓度控制在30-40ng/μL，第二步连接的DNA浓度控制在1.5-2.5ng/μL。
7.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，在所述第一步连接之后还包括通过PCR的方法对连接产物进行一定量的扩增。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述第一步连接之后还包括通过PCR的方法对连接产物进行一定量的扩增。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR采用保真度高的DNA聚合酶，同时将PCR的循环数控制在15个循环以内。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR采用保真度高的DNA聚合酶，同时将PCR的循环数控制在15个循环以内。
11.权利要求1-5任一项或8或9或10所述的方法在构建抗体库、肽库和其他蛋白及cDNA文库中的应用。
12.权利要求6所述的方法在构建抗体库、肽库和其他蛋白及cDNA文库中的应用。
13.权利要求7所述的方法在构建抗体库、肽库和其他蛋白及cDNA文库中的应用。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，未经中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/200910091261.8/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
