[发明专利]miR169d前体序列改造及其在基因沉默中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及miR169d前体序列改造及其在基因沉默中的用途。

背景技术

RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默是一个非常有用和有效的调控基因表达的工具，在基因功能鉴定、植物抗病毒反应、作物品质改良以及农艺性状的改良等方面得到了广泛的应用。在RNAi方法中，目前通用的方法是把需要沉默的目的基因构建成反向重复序列，转录后就形成卡RNA(hpRNA)，随后被DCL酶加工成22nt的小RNA，特异性的沉默同源的靶基因。由于hpRNA可以产生多个～22nt的siRNA，其中的部分siRNA具有作用于其它的非靶基因的潜在能力，可能会影响其他一些无关基因的表达。

随着对miRNA研究的深入，人们发现可以利用miRNA产生的原理来特异性的沉默目的基因，其基本过程是首先获得野生型的miRNA前体(pre-miRNA)，然后根据目的基因序列选择出特异的大小约21nt的序列，即人工miRNA(amiRNA，artificial microRNA)，最后把pre-miRNA中的野生型的miRNA序列替换为目的序列。利用amiRNA人们可以特异高效的沉默目的基因，如miR159a前体、miR164b前体、miR319a前体等均已用来构建人工小RNA载体，但这些miRNA的前体较大，构建需要进行多次嵌套PCR，构建繁琐。

发明内容

基于此，我们对已有的miRNA及其前体进行了分析，发现miR169d特点是前体序列短(154bp)，二级一种结构中的环比较小，且在颈部可只需要改动5个碱基就可以产生2个特异的酶切位点，因此我们选择了miR169d进行amiRNA载体的构建。

因此，本发明的目的之一是提供一种改造的miR169d前体序列amiR169d。

本发明的再一目的是提供miR169d前体序列及其改造序列的用途。

本发明的再一目的是提供含miR169d前体序列及其改造序列的基因沉默载体。

本发明的再一目的是提供制备上述基因沉默载体的方法。

根据本发明改造的miR169d前体序列amiR169d，其核苷酸序列如SEQ No.2所示，其中由碱基“n”组成的序列为任意人工设计的miRNA分子序列。所述片段是拟南芥miR169d前体序列(SEQ No.1，其中由碱基“n”组成的序列为miR169分子序列，可替换为人工设计的任意序列)经过改造而获得。

本发明提供了miR169d前体序列及其改造序列用于制备基因沉默载体的用途。

根据本发明的基因沉默载体含有miR169d前体序列，或经改造的miR169d前体序列，其中，所述miR169d前体序列、或经改造的miR169d前体序列中的miR169d分子序列被特异性的人工miRNA分子取代，优选地，所述改造的miR169d前体序列具有SEQ No.2所示核苷酸序列。

根据本发明的基因沉默载体可以为载体pAmiR169d，所述载体通过上述具有SEQ No.2所示核苷酸序列的经改造的miR169d前体序列克隆至表达载体pCAMBIA1303而获得。

根据本发明的制备基因沉默载体的方法包括将miR169d前体序列，或经改造的miR169d前体序列克隆至表达载体的步骤。

本发明的基因沉默载体是一种能够在植物中特异沉默靶基因的人工miRNA载体。本发明的发明人首次成功地利用miR169d前体分子及其改造序列制备基因沉默载体，其在amiR169d前体序列的颈部结构区域设计了两个特异的酶切位点，可方便的把人工设计的目的序列插入到本发明的载体中，导入植物细胞，可有效引起靶基因沉默。被转化的植物宿主既可以是拟南芥、烟草、大豆等双子叶植物，也可以是玉米、水稻、小麦等单子叶植物。

附图说明

图1为miRNA前体的二级结构图，其中A为改造前的拟南芥miR169d的前体结构；B为改造后的miR169d前体结构；C为人工amiR-gfp的前体结构；

图2为改造的人工miRNA载体pAmiR169d和pAmiR-gfp的构建图；其中35S为花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)蛋白基因启动子；Nos为胭脂碱合成酶(Nos)基因中止子；GUS报告基因；LB和RB为T-DNA左右边界。

图3为pAmiR-gfp对靶基因的沉默效应分析，其中，A为GUS活性分析，B为GUS-GFP转录本的半定量RT-PCR，C为GUS-GFP转录本的实时定量PCR；