[发明专利]鉴定野牦牛遗传资源亲缘关系的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定野牦牛遗传资源亲缘关系的方法。

背景技术

牦牛是青藏高原地区最重要的家畜之一，家养牦牛对高海拔、低气温、少氧的高原生态环境有极好的适应能力，为当地牧民群众提供基本的生产和生活资料。由于自然和社会经济等条件的局限，经营方式落后，饲养管理粗放，导致家养牦牛品种选育缺乏力度，其生产性能逐渐下降，甚至有明显的退化，已不适应高效畜牧业发展的要求。作为家养牦牛的祖先，野牦牛在体格大小，生长发育强度，抗逆性等方面有着明显的优势，因此利用野牦牛育种，使得家养牦牛品种复壮一直是人们关注的内容。然而，目前品种培育中所选用的野牦牛都是通过对一些形态特征的筛选而确定的，这些形态特征可能是由环境的影响造成的，并不能在后代中遗传，使得难以依据形态特征对野牦牛的遗传资源进行鉴定。

线粒体DNA(mtDNA)具有拷贝数高、分子量小、无组织特异性、进化速度快等特点，在遗传上具有自主性，是严格的母系遗传。D-loop是线粒体DNA中变异速率最快的一个片段，研究发现，D-loop的碱基替换速率比mtDNA分子的其它区域高5-10倍。这一片段具有很多的信息位点，在揭示种内不同个体之间遗传差异方面有广泛的应用，利用mtDNA D-loop碱基突变来鉴定不同群体、个体的亲缘关系已经在猪、黄牛、马等多种家畜中开展。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定野牦牛遗传资源亲缘关系的方法。

本发明保护一对鉴定牦牛亲缘关系的专用引物，是序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对。

所述专用引物在制备鉴定牦牛亲缘关系的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种鉴定牦牛亲缘关系的试剂盒，它包括所述专用引物。除了所述专用引物，所述试剂盒还可包括PCR扩增的常规试剂，如缓冲液、dNTP、Taq酶等。

所述专用引物和所述试剂盒在鉴定牦牛亲缘关系中的应用均属于本发明的保护范围。

所述牦牛具体可为野牦牛。

本发明还保护一种鉴定牦牛亲缘关系的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测牦牛的总DNA；

(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板进行PCR扩增；PCR扩增的引物为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对(Floop和Rloop)；

(3)通过PCR扩增产物的核苷酸序列鉴定牦牛的亲缘关系。

所述牦牛具体可为野牦牛。

所述动物总DNA的提取方法可为标准的苯酚-氯仿法。

所述PCR扩增的反应体系具体可如下：双蒸水23.1ul；10×tris-HCl缓冲液(pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl₂)3ul；dNTP(2.5mM)0.7ul；上游引物和下游引物各1ul；Taq酶(5U/ul)0.2ul；DNA模板1ul(50ng)。

所述PCR扩增的程序具体可为：95℃--4分钟；然后以95℃--55秒，50℃--55秒，72℃--55秒，循环35次；最后在72℃保温5分钟。

所述专用引物、所述试剂盒或所述方法均可应用于牦牛遗传资源鉴定。

本发明针对线粒体D-loop设计了一对专用引物，该专用引物可以分析野牦牛与家牦牛的亲缘关系，从而对野牦牛的遗传资源进行鉴定，避免了利用形态学原理进行鉴定时存在的证据不足等问题，因而能够对野牦牛的遗传资源进行更加合理、准确的鉴定。

附图说明

图1为鉴定牦牛亲缘关系的流程图。

图2为123条线粒体D-loop序列所构建的ML树的示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

47个野牦牛样品、407个家牦牛样本；Wiener，G.，Han，J.L.&Long，R.J.(2003)The Yak，2nd edition.The Regional Office for Asia and the Pacific，Food and Agriculture Organizat ion of the United Nations，Bangkok，Thailand.

实施例1、野牦牛亲缘关系的鉴定

对47个野牦牛和407个家牦牛分别进行D-loop测定，每个样品测定步骤如下：