[发明专利]一种用于构建hpRNA的载体、构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于构建hpRNA的载体、构建方法及其应用。

背景技术

hpRNA在植物体内会被处理成为siRNA从而诱导RNA干扰，构建hpRNA被广泛应用于RNA干扰和基因沉默。hpRNA的编码区包含两段反向互补的目的基因片段，两片段之间夹有一段环片段(loop region)。该编码区构建到质粒上，经转录后产生自身互补的单链hpRNA。

目前构建hpRNA的方法虽然已有较大的进展，但仍存在费用高、耗时大、操作繁琐、技术不易掌握等缺陷。hpRNA载体pHANNNIBAL和pKANNIBAL是通过传统的限制性内切酶和连接系统进行构建的(Wesley，S.，Helliwell，C.，Smith，N.，Wang，M.，Rouse，D.，Liu，Q.，Gooding，P.，Singh，S.，Abbott，D.，Stoutjesdijk，P.et al.(2001)Construct design for efficient，effective andhigh-throughput gene silencing in plants.Plant J，27，581-590.)；通过一步或两步PCR得到目标片段，利用限制性内切酶依次连入载体中；除了酶切位点的局限性，该方法的主要问题是其耗时过大，故只能在小规模构建中使用。Gateway系统较传统方法有了较大改进。其主要利用lambda噬菌体生活周期中会与寄主基因组发生位点特异的同源重组的特性，利用LR反应进行构建(Landy，A.(1989)Dynamic，structural，and regulatory aspects of lambda site-specificrecombination.Annu Rev Biochem，58，913-949.)；质粒pHELLSGATE4，pHELLSGATE8和pHELLSGATE12均为通过该系统进行hpRNA构建(Helliwell，C.andWaterhouse，P.(2003)Constructs and methods for high-throughput genesilencing in plants.Methods，30，289-295.)；然而通过前两个质粒进行的构建会出现非预期的位点重组，产生反向无功能的内含子；而通过pHELLSGATE12质粒进行的构建虽然保证了内含子的有效性，但其PTGS的效率不稳定(Wesley，S.，Helliwell，C.，Smith，N.，Wang，M.，Rouse，D.，Liu，Q.，Gooding，P.，Singh，S.，Abbott，D.，Stoutjesdijk，P.et al.(2001)Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing in plants.Plant J，27，581-590.)；更重要的是该方法中用到的酶成本过高。DA-ihpRNA(Xiao，Y.，Yin，M.，Hou，L.and Pei，Y.(2006)Direct amplification of intron-containinghairpin RNA construct from genomic DNA.Biotechniques，41，548，550，552.)方法是基于基因组DNA序列的，其利用特定基因的自身的内含子产生hpRNA；该方法虽然简单快捷，但目标片段的位置受到极大的限制。最近出现了一种一步构建hpRNA的方法，该方法利用ZeBaTA载体(Chen，S.，Songkumarn，P.，Liu，J.andWang，G.(2009)A Versatile Zero Background T-vector System for Gene Cloningand Functional Genomics.Plant Physiol.)；该方法中hpRNA茎环结构是由两段反向的目标序列和任意的中间片段进行搭接PCR得到的；然而，实际操作中，由于PCR抑制效应，通过搭接PCR一步产生hpRNA片段是很难做到的；此外，每个构建都需要通过搭接PCR逐个引入环片段，使得该方法难以作为大规模筛选。MOOE-PCR方法中，同样作为环片段的内含子每次都需要单独引入；且其搭接PCR的条件需要根据不同基因的特性逐个进行优化(Yan，P.，Shen，W.，Gao，X.，Duan，J.andZhou，P.(2009)Rapid one-step construction of hairpin RNA.Biochem BiophysRes Commun，383，464-468.)。