[发明专利]一种液体纤维素酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，具体的说，涉及一种利用半连续发酵 法生产液体纤维素酶的方法。

背景技术

纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富 的可再生性天然资源。据估计，地球上纤维素中所蕴藏的能量大约相 当于6400亿吨的石油所含的能量，而且纤维素的可再生性是石油等矿 质能源所不可比拟的。充分利用纤维素酶处理纤维素，有可能从根本 上解决人类所面临的能源与粮食问题，其深远影响是不可低估的。

然而，目前约80％纤维素未被开发利用，具有极为诱人的前景。 近年来，国内外纤维素酶的应用研究十分活跃，已筛选到一批高产菌 株。纤维素作为一种具有巨大潜力的可再生资源，利用微生物生产的 纤维素酶将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料，对于人类社 会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。

纤维素酶在纺织、食品发酵、饲料、造纸、日用化工、中草药提 取等诸多领域具有广泛的应用，特别是在秸秆生产酒精方面，具有巨 大的潜在价值，其前景十分广阔，纤维素酶的研究已成为一个战略性 课题。

美国杰能科公司和美国国家再生能源实验室合作，在降低纤维素 酶的生产成本方面也已取得重大突破，使生产纤维素酶的成本已降至 10美分～20美分/加仑，达到了预期的降低30倍的目标。意味着实现 生物基乙醇燃料的商业化推广已不再遥远，该研究成果不久将在试验 装置上验证。

纤维素酶在我国每年有几十亿元的市场销售额，在纺织、酒精、 饲料等工业具有广泛的应用，但目前国内90％以上的市场份额被国外 产品所占领，因此开展纤维素酶发酵技术的研究，提高液体发酵酶活 力、降低生产成本具有很重要的现实意义。

纤维素酶的生产和其它酶制剂一样，主要有固体发酵和液体深层 发酵两种，国内外在这方面做了许多有价值的工作。固体发酵法是以 玉米等农作物秸秆为主要原料，其投资少，工艺简单，产品价格低廉， 目前国内绝大部分纤维素酶生产厂家均采用该技术生产纤维素酶。但 是固体发酵法存在着一定的缺陷，以秸秆为原料的固体发酵法生产的 纤维素酶自动化程度低，劳动强度大，产品质量不稳定。

因此，随着液体发酵酶工艺的发展及菌种性能的提高，采用液体 发酵法生产纤维酶素是必然趋势。目前液体纤维素酶的发酵主要采用 分批发酵，发酵周期较长，达7天以上，设备利用率较低，动力消耗 较大，种子的制备成本较高，对原料微晶纤维素和乳糖的消耗较大， 因此成本居高不下。

本发明针对以上缺陷，提出一种利用半连续发酵法制备液体纤维 素酶的方法，可提高设备利用率，同时减少制备种子的费用，而且发 酵液中已有的纤维素酶和微晶纤维素降解物还为后续半连续发酵中 纤维素酶的诱导提供了一个良好的外部环境，减低成本。

发明内容

本发明的目的是针对纤维素酶现有发酵技术的不足，提供一种操 作简便，成本低，酶活力稳定的利用半连续发酵法制备液体纤维素酶 的方法。

本发明所述的制备液体纤维素酶的方法，是采用半连续发酵方式 在培养基中利用微生物发酵生产纤维素酶，包括：(I)将微生物接 种到发酵培养基中保温培养；(II)将步骤(I)得到的培养液的10％-80％ 放出，同时补充相同体积的新鲜发酵培养基并进行培养；循环进行步 骤(II)，放罐。

该方法适用于绿色木霉、黑曲霉、里氏木霉等能够采用该方法制 备纤维素酶的霉菌，优选绿色木霉；

所述发酵培养基中含有1-3％微晶纤维素、2～4％玉米浆、1～3％尿 素、2～5％硫酸铵、2～5％磷酸氢二钾。

所述培养温度为25-32℃；

步骤(I)所述的培养时间为3-7天；

步骤(II)所述的培养时间为12-48小时；

所述步骤(II)的循环次数10～15次。

本发明所述的方法，在步骤(I)之前，还包括种子活化和培养。

所述种子培养的温度为30-32℃。

具体的说，所述种子活化和培养的方法如下：

1)斜面培养：在无菌操作条件下，将原种接入PDA试管斜面培 养基中，30-32℃培养4～8天；

2)振荡培养：在无菌条件下，将斜面菌种接入三角瓶的种子培 养基中，置摇瓶机上振荡培养24～48小时，培养的温度为30-32℃；