[发明专利]一种蛇毒止血酶

说明书

技术领域：

本发明涉及一种蛇毒止血酶，属于生化医药技术领域。

背景技术：

在国外Helleman等(Helleman，W.H.等，1976J.Biol.Chem.，251：1663.)用凝胶层析和亲和层折自巴西矛头蝮(Bothrope jararaca)得到了蛇毒凝血酶(Hemocoagulase、Reptilase)，经测定，该酶分子量为31000道尔顿，为单链，由230个氨基酸组成。V.Klobusitzky(1936)首先发现并研制成止血剂-Reptilase(含2个以上组分)，并申请专利(参见使用说明书)，由瑞士巴塞尔素高大制药厂生产，我国每年进口数百万支Reptilase(我国俗称为“立止血”)，年销值可达2-4亿元(人民币)。

我国萧昌华先生(1990)即从我国特产尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇(湖南产)毒中经阴离子交换、凝胶柱层，再经蛋白纯化仪纯化得到97％以上的尖吻蝮蛇毒凝血酶I、II两个同功酶纯品，已获两项专利(证书号第164674、164675)。尖吻蝮蛇毒凝血酶I已获国家一类新药临床试验批件(批件号：2003L03431)现已进入第二期临床试验阶段；尖吻蝮蛇毒凝血酶II则未进行进一步研究。国内还有些专利报道，但基本属于这两个同功酶类。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种促、凝止血作用显著的高纯度单体止血剂-蛇毒止血酶。

本发明是从我国福建产尖吻吻蝮(Dienagkistrodon acutus)蛇毒中分离纯化得到的单体，经检测，该酶分子量为31000道尔顿，由两个亚组成。经氨基酸序列测定，α-链由135个氨基酸组成，β-链由126个氨基酸组成。蛇毒止血酶氨基酸序列为；

               10        20        30       40        50

α链：DFNCPPGWSAYDQYCYQVIKEPKNWDDAERFCTEQADGGHLVSIESKGER

β链：GFCCPLRWSSYEGHCYLVVKEKKTWDDAEKFCTEQRKGGHLVSVHSREEA

               60        70        80       90       100

α链：DFVAQLVSQSIESVEDHVWTGLRVQNKEKQCSTEWSDGSSVSYENLLELY

β链：DFLVHLAYPILD-LSLIWMGLSN--MWNDCKREWSDGTKLDFKSWAKTS

               110       120        130  135

α链：MRKCGALDRDTGFHKWINLGCIQLNPFVCKFPPQC

β链：--DCLIGKTDG-DNQWLNLDCSKKHYFVCKFKL-

本发明的蛇毒止血酶经如下工艺步骤得到：

1、尖吻蝮蛇毒用Tris-Hcl缓冲液溶解，离心分离，取上清液上柱，经阴离子交换柱层析，用Tris-Hcl缓冲液溶，NaCL直线梯度洗脱，能同时得到5个以上具类凝血酶(Thrombin Like Enzemy)活性组分；

2、经凝胶电泳检测，将其中止血酶组分再经两种以上阴离子交换及凝胶柱层析纯化得精制止血酶溶液，经HPLC色谱及毛细管电泳检测，纯度在98％，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检，本品由两个亚基组成。其得率为6％，1克蛇毒可生产成品1000支以上。

3、将精品止血酶溶液再经脱盐得止血酶原液；

4、将所得的止血酶原液再经配方(加赋型剂、稳定剂)、过滤、分装、冷冻干燥、压盖即得注射用止血酶成品。

5、鉴定止血酶的特征：

(1)蛇毒用Tris-Hcl pH7.5-8.5缓冲液溶解，经阴离子交换剂柱层析，用上述缓冲液，Nacl直线梯度洗脱，能同时得到5个或以上粗分类凝血酶同功酶组分；

(2)将所得到的粗蛇毒止血酶再经不同阴离子及凝胶柱层析纯化，用上述缓冲液，pH7.5-8.5，Nacl 0-1.0M直线梯度洗脱，纯化得精制蛇毒止血酶溶液；

(3)该酶的特征鉴定：

A.经HPLC(正、反相)色谱检测，本品相对含量为98％；

B.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳能见两条亚基蛋白带，其分子量分别为16500道尔顿和14500道尔顿；