[发明专利]外膜蛋白为靶基因的Taqman MGB probe实时荧光定量PCR检测体系确立方法

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，具体地涉及一种以鹦鹉热嗜衣原体的外膜蛋白为靶基因的Taqman MGB probe实时荧光定量PCR检测体系的确立方法。 

背景技术：

鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci，Cps)是衣原体科嗜衣原体属的一个种，属真核细胞内寄生的介于细菌和病毒之间的微生物，是一种重要的人畜共患病原菌，由于该病原菌能引起动物和人的传染性非典型性肺炎，因此由它所引起的鹦鹉热被国际兽疫局(OIE)列为二类传染病，从而在世界范围内越来越备受研究者们的关注；同时由于该病原菌也可以被用作细菌武器，因此在美国也被列入禁止私自转让与出境的病原体之列。鹦鹉热嗜衣原体的宿主广泛，可感染家畜、野生动物尤其是野生禽鸟类和人类，引起非典型性肺炎、结膜炎、鼻炎等疾病。许多人和动物在感染后经常呈隐性感染和无症状带菌状态，并多见于反复感染和与其他病原菌的混合感染，从而增加了临床诊断工作的难度。 

众所周知，血清学试验、微量免疫荧光法(MIF)、补体结合试验(CF)和酶联免疫吸附试验(ELISA)是检测鹦鹉热嗜衣原体感染的常规诊断方法。由于这些方法缺乏特异性，聚合酶链反应(PCR)已成为检测动物源性嗜衣原体感染的一种有用方法。这种技术的优点是易于使用，快速获得结果，更适合于处理大量的标本，但由于该方法需要后PCR处理而无法避免由此而造成的交叉污染，从而在一定程度上影响了检测体系的精确性与可信性。实时荧光定量PCR不失为一种理想的替代方法，不仅该方法中的杂交探针可以提高检测的特异性，而且由于该方法不需进行后PCR处理，因此不会造成交叉污染，从而提高了检测体系的特异性与准确性，至此，它已被证实是一种确实有效的微生物检测技术。国外学者已成功应用衣原体的主要外膜蛋白、热休克蛋白、脂多糖、16S和23S rRNA基因的全长序列为靶基因，通过运 用PCR、DNA杂交技术实施衣原体的检测。实时荧光定量PCR检测技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，其中尤以使用TaqMan probe的方法更是具有特异性强、灵敏性高、重复性好、定量准确、速度快等优点。 

目前，国内外虽然已经成功地利用16S和23S rRNA基因的全长序列为靶基因序列，通过运用PCR等技术实现了衣原体的检测，然而在鹦鹉热嗜衣原体和肺炎嗜衣原体等的检测上，由于其核苷酸序列的同源性很高而不能够实施快速而准确的检测并判别种属，从而造成假阴性或假阳性，为该病原体的确诊造成相当大的难度。 

发明内容：

本发明的目的在于确立一种快速、准确、灵敏度高的鹦鹉热嗜衣原体的检测体系，该检测体系是一种基于鹦鹉热嗜衣原体MOMP基因的VD3区域的核苷酸保守序列设计相应的引物及探针，并以标准菌株DNA样本作为阳性对照所确立的TaqMan-MGBprobe实时荧光定量PCR，用以检测鸟源性鹦鹉热嗜衣原体的快速检测体系，并在特异性、最低检出量等方面进行评价，还可利用该检测体系对不具有感染性的鹦鹉热嗜衣原体的原体进行spike test试验，最终对临床样本进行检测试验。本发明实现了对鹦鹉热嗜衣原体的确实可靠的检测与诊断，确立了一个以鹦鹉热嗜衣原体MOMP基因的VD3可变区域的核苷酸保守序列为基础的TaqMan MGB probe的实时荧光定量PCR检测体系；其次，检测了该检测体系与普通PCR在检测特异性与敏感性上的差异，同时也证实了本发明的方法在临床检验诊断上的应用潜力。 

本发明是以提供了如下的技术方案来实现上述的发明目的的： 

一种以鹦鹉热嗜衣原体的外膜主蛋白为靶基因的特异性Taqman MGB probe实时荧光定量PCR检测体系的确立方法，包括标准菌株的培养和DNA的分离纯化、TaqManMGB probe多重实时荧光定量PCR检测体系的确立，检测步骤的确立。 

标准菌株的培养步骤是选用鹦鹉热嗜衣原体标准菌株通过HeLa 229和Hep-2细胞进行培养，培养后使用Puregene DNA分离纯化试剂盒从没有感染力的鹦鹉嗜衣原体EB中分离纯化基因组DNA。 

TaqMan MGB probe多重实时荧光定量PCR检测体系的确立步骤包括： 

(1)根据鹦鹉热嗜衣原体的MOMP基因的可变区域III VD3，利用Primer express 2.0设计引物和探针： 

两条位于鹦鹉热嗜衣原体的MOMP基因的可变区域III(VD3)位点的引物为： 

PsiMOMP5：5’-TGTGATTCACAAACCAAGAGGCTATA-3’