[发明专利]16S rRNA基因为靶基因的TaqMan probe实时荧光定量PCR检测体系的建立方法

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，具体地涉及一种以动物源性嗜衣原体的16S rRNA为靶基因的TaqMan probe实时荧光定量PCR检测体系的建立方法。 

背景技术：

衣原体是专性细胞内寄生病原体，不同于其它革兰氏阳性细菌，表现在其独特的双向生存周期，即一个细胞外的生存形式——原生小体和一个细胞内复制的形式——网状体，二者之间可相互转化。1999年，衣原体科被分成2个属9个种。其中，衣原体属有3个种，包括沙眼衣原体、猪衣原体和鼠肺炎沙眼衣原体；嗜衣原体属有6个种，即猪流产嗜衣原体、豚鼠嗜衣原体、猫嗜衣原体、兽类嗜衣原体、肺炎嗜衣原体和鹦鹉热嗜衣原体。 

这些微生物是许多人畜共患病的病原体，如沙眼衣原体可导致性传播疾病和沙眼；肺炎衣原体会导致人体引起诸如肺炎、支气管炎等呼吸系统疾病，也被认为是哮喘和动脉粥样硬化等慢性疾病的病因之一；猪流产嗜衣原体、豚鼠嗜衣原体、猫嗜衣原体、兽类嗜衣原体和鹦鹉热嗜衣原体广泛分布于各种动物中，可寄生于哺乳类动物宿主引起流产、肠炎、肺炎、多发性关节炎及生殖道、消化道疾病；鹦鹉热嗜衣原体可感染禽鸟类与哺乳动物引起非典型性肺炎和流产，它也可通过隐性感染或患病动物传播给人体，引发严重的非典型肺炎。 

众所周知，血清学试验、微量免疫荧光法(MIF)、补体结合试验(CF)和酶联免疫吸附试验(ELISA)是检测衣原体感染的常规诊断方法。由于这些方法存在交叉反应从而使其缺乏特异性，而聚合酶链反应(PCR)已成为检测动物衣原体感染的一种确实有效的方法。该方法具有易使用，能快速获得结果，同时适合于处理大量的检体样本等诸优点，但是它无法避免后PCR的交叉污染。实时荧光定量PCR是一种理想的替代方法，由于它无需进行后PCR处理从而不易引起交叉污染，而且杂交探针也可提高检测的特异性，因此它已被证实是一种更确实有效的微生物检测方法。编码16S rRNA小亚基的基因经常被当作PCR检测的靶基因位点，因为它有大量的数据库，在临床检测诊断中具有探索和利用价值。 

由于动物源性嗜衣原体可引起动物和人类的多种疾病，动物以流产、肺炎、肠炎、结膜炎、多发性关节炎及脑脊髓炎等多种病症为主，而人类以发热、头痛和非典型性肺炎为主要症状，同时有报道称与人类的动脉粥样硬化和冠心病也有关。许多人和动物在感染后常呈隐性经过和无症状带菌状态，反复感染和与其他病原菌的混合感染也较为多见，这增加了临床诊断工作的难度。 

目前，国外学者已成功应用嗜衣原体的主要外膜蛋白、热休克蛋白、脂多糖、16S和23S rRNA基因的全长序列为靶基因序列，通过运用PCR、DNA杂交技术及Real-time PCR等技术实施衣原体的检测。而国内主要依据病原体分离和血清学检查对衣原体进行检测。病原分离主要包括鸡胚接种、细胞培养和动物回归试验，其操作程序复杂，而且费时，且结果判定常带有主观性从而使这些方法在检测时受到限制。尤其当由这些病原体引起的爆发时，常由于缺乏快速、准确、敏感的检测方法而贻误疾病的控制，给人类的健康与经济带来巨大的损失。 

发明内容：

本发明的目的是确立一种快速、准确、灵敏度高的基于动物源性嗜衣原体16SrRNA的TaqMan probe实时荧光定量PCR的检测体系。在对其与鹦鹉热嗜衣原体的常用PCR检测体系进行了敏感性和特异性比较的同时，证实该方法可在临床上应用。 

该方法系一种基于嗜衣原体16S rRNA序列设计相应的引物及探针，并以嗜衣原体标准菌株由来的DNA作为模板而确立的TaqMan probe实时荧光定量PCR检测体系，并在检测特异性与敏感性等方面进行了评价，最后应用该检测体系对鸟类临床样本进行了检测，以期评价该检测体系在临床检测方面的应用可能性。 

本发明的目的是通过下述的技术方案得以实现的： 

一种TaqMan probe实时荧光定量PCR检测体系的确立，以动物源性嗜衣原体的16S rRNA为靶基因，包括标准菌株的培养和DNA的分离纯化、TaqMan probe实时荧光定量PCR检测体系与检测步骤的确立。 

标准菌株的培养步骤是选用动物衣原体和嗜衣原体的标准菌株用HeLa 229和Hep-2细胞进行培养，培养后使用Puregene DNA分离纯化试剂盒(Funakoshi，Japan)从没感染力的衣原体EB中分离纯化基因组DNA。 

TaqMan probe检测体系确立的步骤包括：