[发明专利]一种筛选烟草野火病菌拮抗细菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物防治技术，更具体地说，本发明涉及一种筛选烟草野火 病菌拮抗细菌的方法。

背景技术

烟草野火病是由烟草假单胞杆菌(pseudomonas syringae pv.tabaci)引 起的一种细菌性病害，最早于1917年在美国的佛吉尼亚和北卡罗来纳州发 现，现已广泛分布于世界26个产烟国家和地区，是烟草上重要的细菌性病害 之一。我国早在20世纪50年代就于辽宁烟区发现该病，但一直危害不大。20 世纪80年代以来，该病在云南、贵州、河南、山东、湖北、辽宁和吉林等烟 区均有大面积发生，并有逐年加重的趋势，造成了较为严重的经济损失。

野火病菌可随病株残体在田间越冬，也可在其他多种作物和杂草根系存 活，还可以借助烟草种子传播。因此，采用轮作、田间消除病残体等栽培措 施预防该病的发生有相当的难度；药剂防治以利用农用链霉素为主，但链霉 素属于成分单一的抗生素，长期连续施用易使病原物产生抗药性，在一些烟 区已存在不同的抗药性，表现为施用浓度不断提高。在当前缺乏抗病品种的 情况，为有效防治该病，有必要寻找有益细菌，既可以抑制野火病，又可以 延缓病菌的抗药性。因此，筛选高效和稳定的拮抗菌是保证生物防治获得成 功的条件之一，而筛选烟草野火病菌拮抗细菌的方法则是其基础。

筛选烟草野火病菌拮抗细菌的方法主要有平板对峙培养法或代谢产物 活性检测法。由于代谢产物活性检测法中去除活体细菌、获得初提或精提产 物的操作步骤相对较为复杂、烦琐一些，故通常采用此方法不多。目前以平 板对峙培养法筛选为主，有同步与异步两种对峙培养方法。同步对峙培养时 可采用在培养基中混病原细菌倒平板再点接接种待筛选细菌，也可采用夹心 平板；异步对峙培养时通常先培养待筛选细菌至产生抗生素后，再接种病原 细菌，一般可采用夹心平板，也可采用翻转平板，还可清除待筛选细菌、再 涂布病原细菌。同步对峙培养适合于待筛选产生抗生素比病原细菌生长更快 的拮抗细菌；而产生抗生素与比病原细菌生长同步或滞后的待筛选细菌，则 适宜采用异步对峙培养，且往往适合于产生抗生素比病原细菌生长更快的待 筛选拮抗细菌。因此，采用异步对峙培养较多。但是这些异步对峙培养方法 筛选效率较低，有待提高。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种改进的筛选烟草 野火病菌拮抗细菌的方法。该方法能提高筛选效率，丰富异步对峙培养的方 法，加快植物细菌病害的生物防治。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

本发明提供了一种筛选烟草野火病菌拮抗细菌的方法，所述的方法采用 以下步骤：

(1)待测细菌、烟草野火病菌的培养

待测细菌、烟草野火病菌分别置于NA或KB平板上培养，其中待测细 菌采用4～6点点接，烟草野火病菌采用划线接种，28±1℃培养2～3天；

(2)烟草野火病菌悬浮液的制备

取0.1％的吐温80灭菌水溶液10～15ml加入到培养好的烟草野火病菌平 板上，刮下菌苔，转移至灭菌三角瓶中，用0.1％的吐温80灭菌水溶液调节 细菌浓度为10^4～5cfu/ml，即可得烟草野火病菌悬浮液；

(3)烟草野火病菌悬浮液的喷雾弥散

将制备的烟草野火病菌悬浮液转移至消毒、灭菌的小型喷雾装置内，在 已经灭菌的超净工作台上打开培养好的待测细菌平板，于通风状态下，向平 板上方喷雾烟草野火病菌悬浮液，借助风力病菌就均匀弥散到平板上，继续 通风10～15分钟，风干平板表面水份；

(4)对峙培养

盖好皿盖，收取平板，28±1℃继续培养2～3天，观察有无抑菌圈，有 抑菌圈的为筛选获得的目标细菌。

与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：

1.可显著提高筛选效率。采用改进的异步对峙培养方法，待测细菌4～6 点点接，培养2～3天，再喷雾弥散烟草野火病菌悬浮液。这种对峙培养接种 病原细菌采用喷雾弥散的方法，可以批量进行，在100个以上的待测细菌以 上时能提高20％～30％的效率；

2.本发明除适用于烟草野火病菌拮抗细菌筛选外，也可适用于其它细菌 病原拮抗细菌的筛选，适应范围广。

附图说明

图1显示待测细菌有抑菌圈；

图2显示待测细菌无抑菌圈。