[发明专利]人呼吸道合胞病毒的裂解方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人呼吸道合胞病毒(HRSV)颗粒的裂解方法，属于生物学技术领域。

背景技术

人呼吸道合胞病毒(HRSV)是一个世界范围内严重危害婴幼儿健康的最为常见的呼吸道感染性病原体，首次感染多发生在1岁以内的幼儿，尤其是2-6个月的婴幼儿，是造成婴幼儿期住院的主要原因之一，同时也是儿童支气管哮喘发生的重要危险因素之一。HRSV也能造成成年人感染，大约50％的成人的哮喘加重是由HRSV感染引起的。该病毒经空气飞沫和密切接触传播，易于传染并形成大爆发，危害极大。目前对HRSV性哮喘可采用的静脉用免疫球蛋白和人源性中和HRSV F蛋白的单克隆抗体。抗病毒HRSV药物存在的缺陷是一旦临床症状和体征出现，病毒复制就已经开始，而抗病毒药物只在一定程度上缓解临床症状和缩短患病时间。因此，预防性给予抗病毒药物将会是最有效的措施。而目前针对HRSV病毒，尚无理想的疫苗可用。考虑到HRSV感染的发病率和死亡率，研制HRSV疫苗显得尤为突出。

由于HRSV传统的减毒活疫苗及灭活疫苗的研究都难以在短期内难有实质性的突破，因此，近年来对RSV疫苗研究主要集中在裂解纯化疫苗。HRSV编码11个蛋白质，膜表面主要有F蛋白和G蛋白两个功能蛋白，这2个膜蛋白能诱导机体产生中和性保护抗体和细胞免疫。

根据研究，用天然病毒的某些化学成分制成的亚单位疫苗，是比较安全的，同时由于仅用病毒的部分成分做疫苗，还可去除病毒颗粒中一些会引起不良反应的成分，有针对性的刺激机体的免疫反应。因此，通过筛选及优化HRSV的裂解、纯化方案，获得具用免疫原性的HRSV亚单位蛋白组分F蛋白及G蛋白，研发HRSV裂解亚单位疫苗具有重要意义，尤其是研究裂解疫苗的技术更为必要。

发明内容

本发明的目的就是提供一种人呼吸道合胞病毒的裂解方法，以获得具有完全免疫原性的抗原蛋白——人呼吸道合胞病毒(HRSV)的F蛋白和G蛋白，从而诱导能保护下呼吸道的中和抗体反应。

本发明通过下列技术方案完成：一种人呼吸道合胞病毒的裂解方法，其特征在于经过下列步骤：

A、将人呼吸道合胞病毒经常规沉淀、浓缩成病毒液；

B、在上述A步骤的病毒液中，加入NP-40至最终体积浓度为1～2％，或者加入去氧胆酸钠至最终质量浓度为3～4％，混合均匀后，在20～37℃下裂解90～120min，得人呼吸道合胞病毒HRSV的F蛋白和G蛋白。

所述人呼吸道合胞病毒(HRSV)采集于发病2-3天的患者咽式子，经常规方法分离后，用人二倍体KMB₁₇细胞按常规方法培养收获而得。所述NP-40、去氧胆酸钠均为市购分析纯产品。

本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，可有效地对人呼吸道合胞病毒(HRSV)颗粒进行裂解，直接获得免疫原性较完整的目的蛋白——人呼吸道合胞病毒(HRSV)F蛋白和G蛋白，与现有的人呼吸道合胞病毒(HRSV)的重组疫苗和核酸疫苗相比免疫原性更好，可诱导机体产生有效的免疫应答，同时可以去除减毒活疫苗病毒颗粒中一些引起不良反应的成分，提高疫苗的安全性。

所得蛋白经电泳检测，从电泳图上能够观察到两条目标蛋白，且目标蛋白条带的量较多，并可通过Western-blot实验鉴别出目标蛋白具有特异的免疫原性，说明NP-40、去氧胆酸钠这2种裂解剂对人呼吸道合胞病毒(HRSV)的裂解效果较其他常用裂解剂好，可作为裂解疫苗的较佳裂解剂。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

一步骤、病毒的培养

1)取现有技术中的常规人二倍体KMB₁₇细胞致密单层，按1∶2的比例传代，37℃孵箱培养55小时；

2)当细胞面积为90％单层时，在250cm²塑料培养瓶中接种1.5ml人呼吸道合胞病毒HRSV种子，并加入常规细胞维持液150ml，静置于37℃孵箱中培养，每次均设立正常细胞对照；其中：该人呼吸道合胞病毒HRSV种子是按常规采集于发病2天的患者咽式子，经常规方法分离纯化而得，并已适应人二倍体KMB₁₇细胞，其病毒滴度为6.5logCCID₅₀；

3)显微镜下观察细胞病变达80％时，收获病毒液冻存于-20℃备用。

二步骤、病毒液初纯和浓缩

(1)将600ml一步骤3)的病毒收获液融化后，收集于离心管中，以3000rpm的转速在4℃下离心30min，弃沉淀，取上清；