[发明专利]酵母G418为选择性标记的质粒的构建方法

权利要求书

1.酿酒酵母G418抗性筛选标记质粒的构建方法，包括下述步骤：

(1)kanR基因序列的克隆，以pPIC9K为模板，通过PCR扩增，扩增上 游引物序列为5′-CATGCCATGGTCTGCCAGTGTTACAACCAAT-3′，扩增下游 引物序列为5′-CTAGCTAGCATGCGACTCCTGCATTAGGAAG-3′；

(2)回收、纯化PCR产物，利用限制性内切酶Nhe I和Nco I对其进行 酶切；

(3)用限制性内切酶Nhe I和Nco I酶切质粒pYES2；

(4)回收、纯化酶切产物，在16℃连接8小时，获得以G418为抗性筛 选标记的质粒。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于kanR基因序列的克隆PCR反 应体系为50μL，由10μL10×E_x-Taq buffer、0.6μLE_x-Taq DNA聚合酶5U/μL、 2.6μL10mM dNTP、0.5μL上游引物10pmol/μL、0.5μL下游引物10pmol/ μL、0.2μLpPIC9K100ng/μL和35.6μL无菌水组成；PCR反应条件：94℃预 变性5min，94℃变性1min，52℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，共30个循 环，72℃延伸10min；所用的10×E_x-Taq buffer中含有Mg²⁺。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于回收、纯化PCR产物首先用限 制性内切酶Nco I对步骤(1)所得PCR产物进行双酶切，酶切体系为50μL， 由2μLNco I、5μL10×K buffer、5μL0.1％BSA与38μL无菌水组成；纯化后 使用限制性内切酶Nhe I进行二次酶切；酶切体系为50μL，由2μLNhe I10 U/μL、5μL10×M buffer和43μL无菌水组成。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于酶切质粒pYES2，首先用限制 性内切酶Nco I对pYES2酶切，酶切体系为50μL，由2μL的10U/μL Nco I、5μL10×K buffer、5μL0.1％BSA与38μL无菌水组成，酶切产物经 纯化后使用限制性内切酶Nhe I进行第二次酶切，酶切体系为50μL，由2μ L10U/μL Nhe I、5μL10×M buffer与43μL无菌水组成。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于纯化方法为乙醇沉淀法。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于构建以G418为抗性筛选标记 的质粒是用步骤(2)和(3)中的限制性酶切产物，在16℃的条件下连接8小 时，得以G418为抗性筛选标记的质粒；连接体系为10μL，由1μL10×T4 DNA连接缓冲液、0.5μL T4DNA连接酶350U/μL、步骤(2)和(3)中限 制性酶切后的kanR基因和pYES2质粒片段的量分别为1μg和7μg，以蒸馏 水补足至10μL。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中获得的质粒进一步 转化E.coli DH5α进行保存扩增。