[发明专利]一种非动物源性细胞培养血清替代物及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种非动物源性细胞培养血清替代物及其作为胎牛血清 等的替代物在细胞培养中的应用。

(二)背景技术

在常规的细胞培养、扩增过程中，动物源性血清如胎牛血清(FBS) 是细胞扩增必须的添加成分。

再生医学的细胞治疗手段中，临床使用的种子细胞不仅有数量要求， 并且需要保证其安全有效，动物源性血清参与细胞培养虽然能满足数量 需求，却给临床治疗带来了不安全隐患。而自体来源的血清无论获得及使 用都有诸多不便，无法达到使细胞快速扩增的效果，也无法满足临床细胞 治疗对于细胞数量的需求。

(三)发明内容

本发明目的是一种非动物源性细胞培养血清替代物及其作为胎牛血 清等的替代物在细胞培养中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种非动物源性细胞培养血清替代物，由如下方法制备得到：取3～5 体积单位O型的血沉棕黄层和1体积单位AB型的血浆混合，300～400g 离心，取上清液作为一个体积单位的富含血小板血浆；将富含血小板血浆 过滤除去白细胞，-10℃以下冷冻保存备用，使用前30～37℃解冻、 3000～5000g离心去除血小板膜碎片，既得所述非动物源性细胞培养血清 替代物，以PLT表示。

血液：由液体成分的血浆和悬浮于其中的血细胞组成，合称为全血。 血浆：离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞 成分的液体，即血浆。血清：离体的血液凝固之后，经血凝块聚缩释出的 液体，即血清。粗略的说，血清与血浆的区别，主要在于血清不含纤维蛋 白元。血沉棕黄层富含血小板，是全血经重离心获得的沉淀部分，上清部 分即为血浆。

具体的，所述非动物源性细胞培养血清替代物由如下方法制备得到： 取4体积单位O型的血沉棕黄层和1体积单位AB型的血浆混合，341g 离心6min，取上清液作为一个体积单位的富含血小板血浆；将富含血小 板血浆过滤除去白细胞，-30℃冷冻保存备用，使用前37℃解冻、5000g 离心5min去除血小板膜碎片，既得所述非动物源性细胞培养血清替代物， 即PLT。

本发明还涉及所述的非动物源性细胞培养血清替代物作为胎牛血清 替代物在细胞培养中的应用。

所非动物源性细胞培养血清替代物作为胎牛血清替代物可用于培养 间质干细胞、人软骨细胞、人肌腱细胞或皮肤人成纤维细胞等常规细胞的 培养。所述培养仅仅是以PLT替代胎牛血清，其他参数可按照本领域常 规方法进行。

所述PLT在细胞培养基的用量可参照胎牛血清用量，优选的，本发 明中所述的应用为：在DMEM培养液中添加10％体积的PLT，作为待用 培养基基本组分，用于细胞培养，培养基中其他附加组分，如肝素、双抗 等，按常规用量即可。

本发明方法能够避免使用动物源性血清，避免了异种添加物的高危险 性；而制备及利用人血小板溶血产物(HPL)作为血清替代物进行细胞培 养，不仅能够刺激细胞在短期内大量扩增，还能够维持干细胞的多向分化 潜能，不影响细胞质量。

这种细胞培养及扩增方法，不仅有利于加速实验研究进程，更有利于 缩短临床使用周期。

本发明的有益效果主要体现在：利用PLT作为胎牛血清替代物用于 细胞培养，能够免除细胞培养中的动物源性成分，加速细胞倍增，从而满 足临床安全和缩短手术周期需求，不仅适用于间质干细胞，亦适用于其他 人源细胞的扩增培养。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1：PLT获得方法具体操作步骤

(1)采全血(450ml+45ml)，至血袋(枸橼酸盐磷酸盐右旋糖血袋)；

(2)22℃静置16小时后，血液离心(4250g，13min，22℃)，分离红细 胞和血小板，得到血沉棕黄层和血浆。仪器(CompomatG3，NPBI， Amsterdam，the Netherlands))；

(3)为避免MSC引发凝集反应；四单位的O型血沉棕黄层混合一单位 的AB血浆，轻柔离心(341g，6min，22℃)作为一个单位的富含 血小板血浆(PRP)。PRP转移入贮存袋，过滤除去白细胞。-30℃ 冷冻保存。使用前，37℃解冻离心(4000g，15min)，去除PLT膜 碎片，降低引发异体之间的免疫应答的危险。