[发明专利]大黄鱼精子超低温冻存方法及冻存装置

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类精子超低温冷冻保存方法，具体涉及大黄鱼精子超低温冻存方法及 冻存装置。

背景技术

大黄鱼是我国名贵的海产经济鱼类，东南沿海重要的养殖种，目前大黄鱼自然资源 稀少，养殖大黄鱼不同程度地出现种质退化现象，影响其养殖业健康可持续发展。鱼类 精子超低温冻存是种质保存的有效途径之一，将大鱼类的优质精子超低温冷冻起来，建 立精子库长期保存，对其种质资源的保护具有重要意义，亦能为品种改良及新品种培育 提供优良种质材料。

目前，鱼类精子超低温冻存主要采用计算机控制的程序降温仪降温法及简易降温装 置分步降温法。程序降温仪体积较大、操作较复杂，适合在实验室内使用，不方便携带 到野外使用；简易降温装置可根据使用要求自行设计、费用省、体积小而轻，方便携带 到野外使用。由于鱼类精子的采集地往往在野外，离实验室较远，而且鱼类精子采集后， 其活力在1～2小时之后会逐渐减弱，因此，将采集的精子通常采用简易降温装置分步降 温法超低温冷冻精子。如中国专利公开号为101088511，公开日为2007年12月19日， 名称为鱼类精子超低温冷冻保存简易方法发明专利申请就公开了鱼类精子经稀释液稀 释，冰箱内平衡后，加入抗冻剂二甲基亚砜(DMSO)，然后分装到麦细管中，将麦细 管放置于在泡沫箱内浮于液氮上面的中空泡沫板上，保持20分钟时间后，将麦细管置 于液氮中至少5分钟，再转入液氮罐长期保存。该方法适于淡水鱼类精子的超低温冻存， 由于海水鱼类精子与淡水鱼类生理特性上的差异，海水鱼类的精子寿命较短，该方法对 大黄鱼等的海水鱼类精子的冷冻保存适用性较差，如精子存活率较低，精子的保存质量 较差，精子冻存后的激活率相对较低。另外该方法是将盛精液的麦细管放置于泡沫箱内 浮于液氮上面的中空泡沫板上，由于泡沫板被液氮蒸气笼罩，往上放麦细管时看不太清， 操作不方便，延误冻存时间，还容易发生麦细管放置不当而直接掉入液氮中的失误操作， 而且中空泡沫板要放入泡沫箱内，要求泡沫箱体积相对较大，为此我们研究发明了对大 黄鱼较好的简易冻存方法和冻存装置。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作方便，精子存活率较高，精子的保存质 量较好，精子冻存后的激活率相对较高的大黄鱼精子超低温冻存方法。

本发明还提供了用于上述冻存方法的冻存装置，该冻存装置具有操作较方便，避免 了开盖后液氮蒸气笼罩现象，节约冻存时间，避免了麦细管滚动而掉入液氮现象等优点。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：大黄鱼精子超低温冻存方法，包括 下述步骤：

1)抗冻液配制：按体积比85～90∶10～15将稀释液与抗冻剂混合均匀，配制成抗 冻液置于4℃温度条件下保存待用，常用抗冻剂为二甲基亚砜(DMSO)；

2)精子采集：挑选性腺发育成熟的雄性大黄鱼，擦干其生殖孔周围体表，轻压鱼 腹获得精液，置于培养皿或小烧杯中，放于冰浴上；

3)抗冻液与精液的混合液的配制：按体积比1∶2.5～3.5，将上述步骤2的精液与 上述步骤1的抗冻液混合均匀，得到混合液，在4℃温度条件下平衡10～15分钟；

4)混合液分装：将平衡后的0.35～0.45毫升混合液装于0.5毫升的麦细管中；

5)混合液冻存：将上述步骤4的麦细管搁置于简易盛有液氮的冻存装置的凹槽中， 所述凹槽与所述液氮的液面的距离为2.5～3.5厘米，盖上冻存装置的盖保持2.5～3.5分 钟，然后开盖将所述麦细管投入所述液氮中，再盖上冻存装置的盖保持4～6分钟，开 盖捞出所述麦细管立即转入液氮罐中保存。

在上述步骤1中，所述稀释液与所述抗冻剂的体积比为86.7∶13.3，该稀释液与抗 冻剂的比例对具有较好保证冻存的大黄鱼的精子的质量的效果。

所述稀释液为按下述配方配制而成：

NaCl：  7.25克    KCl：        0.38克    CaCl₂：        0.18克

NaHCO₃：1.00克    MgSO₄·7H₂O：0.23克    NaH₂PO₄·2H₂O：0.41克