[发明专利]一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺，属生物医药制造领 域。

背景技术

白喉是急性呼吸道传染病，白喉杆菌侵入人体后在鼻咽部生长繁殖，导 致局部炎症及组织坏死并产生外毒素(分子量为62000蛋白质，为一多肽链)， 咽喉部的坏死组织形成灰白色假膜并继续蔓延而引起呼吸障碍甚至窒息。外 毒素可致心肌、神经系统、肝、肾及肾上腺等器官受损，出现全身中毒症状。 白喉类毒素可使白喉流行得到有效控制。国内原生产白喉类毒素，白喉疫苗 的厂家为中国生物制品集团公司下属的六大生物制品研究所，其工艺如下：

固体培养基传代→液体培养基发酵罐培养→离心去菌体→一段盐析→ 二段盐析→超滤脱盐→除菌过滤→脱毒→原液检定保存→半成品配制→成品

工艺阐述：(1)菌种制备：将白喉38007菌种开启并接种于吕氏血清斜面 培养基上，34℃～35℃孵箱培养16小时～24小时，再由血清斜面传于黄氏马 丁肉汤(或改良林氏肉汤)培养基种子管，34℃～35℃培养16小时～24小时 为第二代，如此循环由黄氏马丁肉汤传至黄氏马丁肉汤第二代，镜检合格者 传于10L瓶，34℃-35℃培养48小时。(2)大罐培养(培养基主要为肉源胰 酶消化液)毒素培养以抽样3次，6小时内絮状单位不上升为停止培养指标。 用于生产的毒素不得低于150Lf/ml。(3)杀菌：将培养液冷却至28℃以下，按 培养基的0.1％-0.15％加入甲醛溶液。(4)一段盐析(去除大分子杂蛋白)：离 心机去除菌体，经浓缩，加入23％(W/V)晶体硫酸铵、1％(W/V)活性炭， 然后加入0.5％(W/V)碳酸氢钠。收集上清。(5)二段盐析(去除小分子杂蛋 白)：缓慢加入22％(W/V)晶体硫酸铵，收集沉淀用无菌的0.1％碳酸氢钠 溶液浸泡沉淀。用无菌的0.1％碳酸氢钠(NaHCO₃)溶液分次溶解、洗涤沉 淀，送超过滤脱盐。(6)超滤脱盐：将精制毒素溶液泵入超过滤系统，直至测 定样品硫酸铵含量低于千分之一即可收集脱盐后精制白喉毒素液。(7)除菌过 滤：用除菌过滤膜除菌过滤。(8)脱毒：精制白喉毒素按0.5％计算加入福尔马 林溶液(按40％计算)及适量的10％L-赖氨酸溶液放置室温2天-3天，每日 振摇一次，然后放入36℃-37℃恒温室，进行脱毒。(9)精制类毒素原液检定： 毒性逆转试验，理化性状，无菌试验，Lf值测定，纯度，特异性毒性试验。 保存与效期保存于2--8℃冷库中，效期自脱毒合格之日起为3年半。其不足 之处：虽然，国内已有吸附白喉疫苗、DTP、DtaP、吸附白破二联疫苗上市， 但其生产过程中由于工艺的限制，成人免疫时有严重的不良反应， Pappenheimer认为，可能是对白类过敏，或对细菌的非毒素蛋白过敏，也可 能对二者都过敏，Henncq给对原制白类过敏者接种无毒白喉杆菌培养滤液 时，受实者呈阳性反应。在过量铁培养液中培养白喉，铁抑制了白喉毒素的 形成，但不能抑制致敏原的形成。证明成年人接种白类容易引起过敏反应， 是因为曾经在上呼吸道感染过无毒力或毒力很小的白喉杆菌，这些菌体的非 毒素蛋白使其致敏，当再接种白类时，白类中含有少量此种蛋白而引起过敏 反应。固如果能制备出高纯度的精制白类有利于降低不良反应，国外生物制 品规程规定，精白类的纯度应不低于2500lf/mgPN。而我国规程规定不低于 1500lf/mgPN。因此用于成人免疫的精白类有必要进一步纯化，提高纯度。

发明内容

设计目的：避免背景技术存在的不足之处，设计一种各项质量指标均达 到《中国药典三部》吸附白喉疫苗要求，尤其纯度指标达到2600lf/mgPN以 上的一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺。

设计方案：本申请在国内生产白喉类毒素工艺的基础上进行工艺改进， 增加了将所用培养基超滤去除未消化彻底的蛋白降解物，二次盐析后脱盐后 再经凝胶过滤工艺，其各项质量指标均达到《中国药典三部》吸附白喉疫苗 要求，尤其纯度指标达到2600lf/mgPN以上，制品中的白喉类毒素纯远高于 同类制品中的纯度，使制品更加安全。

白喉类毒素工艺流程：固体培养基传代→(液体培养基经处理去除分子 量在50000以上的蛋白等)液体培养基发酵罐培养→离心去菌体→一段盐析 →二段盐析→超滤脱盐→凝胶过滤→除菌过滤→脱毒→原液检定保存→半成 品配制→成品；

关键技术有两点：