[发明专利]Aβ1-40重组腺病毒以及采用该病毒制作阿尔茨海默病模型的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种重组腺病毒及采用该病毒制作阿尔茨海默病模型的方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一种病因未明的疾病，主要症状是智能的全面下降，导致生活能力的丧失，是导致老年人残疾的重要疾病之一。病因及发病机制尚不完全清楚，脑内特征性病理改变为老年斑(senile plaque，SP)、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)及神经元丢失。这些损伤主要发生于前脑基底、海马和大脑皮质。对AD的最后诊断需要脑病理学的确诊，但目前没有办法在活体中进行，因此临床诊断主要根据症状学、病史、影像学，因此对AD的发生机制、药物研制带来极大的困难。建立理想的AD动物模型对探明AD的病因、病机和病理过程以及筛选防治AD新药至关重要。

目前常用的模型主要有转基因模型、Aβ注射模型等。但是在这些动物模型的制作中，存在以下几个问题：

1、基因模型具有一定的优势：脑病理变化与人类相似，可模拟AD的年龄依赖性老年斑的形成、胶质细胞增生和突触减少等部分神经病理特征，并表现出与AD临床相似的行为学障碍。但也有明显的不足：缺乏Tau蛋白改变，如NFT的形成和AD相似的神经元变性，而且费用昂贵，一般实验室不具备制作该模型的条件。另外，AD是一种多基因疾病，尽管转基因模型是AD动物模型中较理想者，但转基因模型大部分只模拟了AD的某一方面病理特征，而不能全面模拟AD发病。

2、Aβ注射模型模拟了Aβ沉积神经变性的优点，但存在以下的不足：(1)对动物导入Aβ的同时，注射本身将对脑组织形成局灶性穿透性损伤；(2)大量的Aβ聚集在注射位点局部而不是弥散地分布到脑内；(3)不能体现NFT等病理改变，由于Aβ的自身清除机制，沉积达不到满意的效果。

3、其它动物模型的制作，主要存在与病理改变过程或与AD实际病理改变关系不密切，如铝中毒模型、胆碱能神经损害模型、D-半乳糖制作脑老化小鼠衰老模型、快速老化模型等。

因此，如果能建立一种较理想的AD动物模型，对AD的研究有良好的科学意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用可诱导阿尔茨海默病的基因Aβ1-40cDNA重组的腺病毒，其特征在于，该重组腺病毒包含有Aβ1-40基因。

所述重组腺病毒的构建过程包括如下步骤：

一、合成全长Aβ1-40基因。

二、用高保真Taq酶(pyrobest)扩增第一步得到的Aβ1-40基因片段，并纯化，得到Aβ1-40PCR纯化物。

三、用BgLII和Hind III分别双酶切PSC质粒和第二步得到的Aβ1-40PCR纯化物，将两者的酶切产物纯化后洗脱DNA，然后进行连接反应，得到重组PSC-Aβ1-40穿梭载体。

四、用PmeI酶切第三步得到的重组PSC-Aβ1-40穿梭载体后纯化，将纯化的酶切产物在BJ5183-AD-1感受态细菌中电转化，使重组PSC-Aβ1-40穿梭载体定向插入Adeno-X腺病毒表达载体，得到Aβ1-40重组腺病毒载体质粒。

五、用第四步得到的Aβ1-40重组腺病毒载体质粒在AD293细胞溶液中进行转染，获得Aβ1-40重组腺病毒。

本发明中获得重组腺病毒的活性可以分别用Western-blot检测Ad-Aβ1-40在PC-12细胞中的表达；以及用MTT法、流式细胞仪检测Ad Aβ1-40对PC-12细胞凋亡的影响来检测Ad Aβ1-40的活性。

本发明所述的Aβ1-40重组腺病毒具有高效表达及高效转染的特点，与Aβ1-40多肽相比，作用更持久。

本发明的另一个目的是提供一种用Aβ1-40重组腺病毒制作阿尔茨海默病模型的方法，其特征在于，采用本发明提供的包含有Aβ1-40基因的重组腺病毒制作阿尔茨海默病模型。具体的说，是在实验体大脑的海马部位注射Aβ1-40重组腺病毒溶液。

其具体过程为：将大鼠麻醉后，将AdAβ1-40注射至左、右侧海马齿状回背侧细胞带区。4周后观察大鼠学习记忆的变化及脑组织的病理变化。

本发明用Aβ1-40重组腺病毒制作阿尔茨海默病模型，其过程中构建好AdAβ1-40重组腺病毒后，可以利用病毒的特点，通过细胞培养，将Ad Aβ1-40重组腺病毒传代，获得的Ad Aβ1-40重组腺病毒成本相对低，而且病毒表达稳定，持续均一。有效的避免了以往的模型制作时注射次数多，并且受多肽质量的影响，制作的模型受Aβ1-40批间差异影响等缺点。

附图说明