[发明专利]海雀稗耐寒体细胞突变体筛选方法

说明书

技术领域

本发明海雀稗耐寒体细胞突变体筛选方法，涉及一种适用于植物细胞离体培养植株再生和体细胞突变体定向筛选方法，属于植物培养方法技术领域。

背景技术

海雀稗(Paspalum vagina tum Sw.)作为草坪草，在世界热带与亚热带地区广为种植，是继狗牙根、结缕草和假俭草等暖季型禾草之后兴起的后起之秀(解新明，卢小良.海雀稗种质资源的优良特性及其利用价值[J]，华南农业大学学报，2004，25(增刊II)：64-67)。近年来海雀稗在苏、浙、沪地区得到推广种植，但其绿期与当地种植的狗牙根和结缕草相比短7-25d，迫切需要提高海雀稗的耐寒性，延长绿期。三倍体的海雀稗因花粉败育、自交不亲和等障碍(马国华，赵南先.雀稗属细胞学和繁殖生物学研究[J]，亚热带植物科学，2003，32(3)：5-9)，给常规育种工作带来困难。

植物体细胞突变体筛选技术为植物品种改良开辟了细胞和分子生物学育种新途径。体细胞突变体筛选是在植物细胞培养过程中，结合施加相应的选择压进行定向诱变，有利于筛选出期望的体细胞突变体。国外一些学者以-3℃作为组织培养中诱导筛选耐寒变异的胁迫条件，在烟草、辣椒、胡萝卜、水稻等作物上得到耐寒的愈伤组织，但最终都未能分化出再生植株(Takeuchi M，Tetuo N，Huruya P.Plant tissue culture technology[M].AsakuraPublishing Co.Lid，1984，105-106；Japan Agriculture，Forestry andFisheries Technology Conference Services Bureau.1987，Experimentsstudy the achievement book，III 68-69)。在水稻上，金润洲等通过愈伤组织在15℃下连续继代培养3个月，获得了耐冷突变体材料(金润洲，都兴林，王景余，等.粳稻体细胞耐泠变异的诱导筛选技术[J].作物品种资源，1999，(2)：27-29)。；翟国堂以4℃的温度处理愈伤组织，供试的4个品种都得到了耐寒变异株系(翟国堂.水稻变异体筛选[J].广西农业大学学报，1996，15(3)：209-213)；Bert in和Bouharmont则以5-10℃为选择压，在4个品种中获得了耐寒突变体(Bertin P，Bouharmont J.Use of somaclonal variationand in vitro selection forchilling tolerance improvement in rice[J].Euphycita，1997，96(1)：135-142.)。

发明内容

本发明的技术任务是以海雀稗的颗粒状胚性愈伤组织为材料，温度设置为0℃，研究低温培养条件对愈伤组织生长和绿苗分化的影响，运用离体培养技术从耐寒突变细胞再生出植株，建立海雀稗耐寒体细胞突变体筛选方法，获得海雀稗耐寒突变体植株。为此，本发明采用以下技术方案：

1、海雀稗耐寒体细胞突变体筛选方法，其特征是：

1)材料

选用海雀稗的颗粒状胚性愈伤组织为材料，0℃为低温筛选压；

2)培养基

基本培养基由MS大量元素、MS微量元素与B₅维生素组成，添加蔗糖30g/L；

愈伤组织继代培养基：是在基本培养基中附加以下激素组成：2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L，6-苄基氨基嘌呤0.05mg/L，琼脂条16g/L；

愈伤组织分化培养基：是在基本培养基中附加以下激素组成：6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L，琼脂条8g/L；

上述培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；

3)方法

将颗粒状胚性愈伤组织在愈伤组织继代培养基上进行增殖培养，用作低温处理材料；冰箱温度设置为0℃，低温培养时间分别为60d；经过低温培养和筛选的愈伤组织转移到愈伤组织分化培养基上形成绿苗；绿苗再转移到愈伤组织分化培养基上，发育成具有根、茎、叶的完整再生植株。

作为对上述技术方案的进一步完善和补充，本发明还包括以下附加的技术特征，以便在实施时根据需要选用：

所述的愈伤组织继代培养在散射光下进行。

所述的愈伤组织低温培养在无光源的冰箱内进行。

所述的愈伤组织分化在光照条件下进行。

所述的培养室温度为26±2℃，光照强度为1500lx，光照时间为16h/d。

本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：