[发明专利]用于烟叶烟碱降解的假单胞菌ZCJ菌株及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物降解烟叶烟碱的技术，尤其涉及一种用于烟叶烟碱降解的假单胞菌ZCJ菌株及其筛选方法和应用。

背景技术

受天气、气候以及栽培等因素的影响，烟叶的烟碱(尼古丁)含量存在一定的波动性，易导致卷烟内在质量的不稳定性。同时，相对于降低焦油和烟气有害成分而言，烟草中烟碱(尼古丁)的降低尚未取得突破性的进展。

相对于农业田间管理降低烟碱方法而言，微生物易于培养，降解烟碱的见效快，而且有选择性和可控制性，对香烟品质还会产生其他有益的作用；但是迄今已发现的微生物降解菌的烟碱降解能力不是很强，耐受烟碱浓度较低，影响了其在生产中应用。因而筛选较高活性尼古丁降解菌种，选择合适的生物反应工艺，来实现烟碱的有效降解，控制其含量，是烟草行业的一个热门研究课题和研究方向。

中国发明和专利申请(申请号为：200710013068.3)公开了一种可以代谢尼古丁的恶臭假单胞菌，该菌株已于2005年4月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，其保藏编号为：CCTCC NO.M 205038。中国发明和专利申请(申请号为：200710013069.8)公开了一种可以代谢尼古丁的根癌土壤杆菌，该菌株已于2006年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，其保藏编号为：CCTCC NO.M 206131。上述的两款菌株具有较强的尼古丁代谢能力和尼古丁毒性抗性能力，可以利用菌株的完整细胞为生物催化剂，可将烟草加工废水中的尼古丁彻底生物降解。

中国发明和专利申请(申请号为：200710070805.3)公开了一株新的尼古丁降解菌-假单胞菌ZUTSKD及其应用。假单胞菌ZUTSKD(Pseudomonassp.ZUTSKD)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年6月18日，保藏编号CCTCC NO：M 207083。该菌可将尼古丁降解，能耐受的最高尼古丁浓度为5.5g/L，能够降解废弃烟末中的尼古丁，在工业上有一定的应用前景。

上述的三个专利涉及的菌株对尼古丁具有有效的降解性能，适用于废弃尼古丁的处理，唯一的缺点是都是涉及液体状态下的尼古丁降解，对于固态的烟叶是否具有作用还未经实验证实。

发明内容

为了解决上述的问题，本发明的一个目的是提供一种假单胞菌ZCJ菌株，该菌株具有较高生物活性，适用于固态的烟叶烟碱的降解。本发明的第二个目的是提供上述的假单胞菌ZCJ菌株的筛选方法。本发明的第三个目的是提供上述的假单胞菌ZCJ菌株的应用。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

假单胞菌ZCJ菌株，该假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)已经于2009年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCCNO.M209064。

上述的菌株形态鉴定：该菌株为革兰氏阴性菌，无芽孢。电镜观察发现，该菌鞭毛端生，鞭毛数1-3根。在BSM琼脂培养基上菌落为白色，光滑，边缘成齿状。生理生化鉴定：该菌株好氧，能以尼古丁为唯一碳、氮源生长。吲哚实验、甲基红实验、V.P.实验、淀粉水解实验均成阴性，氧化乳糖不产酸不产气。该菌株16S rDNA序列全长1417bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

为了实现上述的第二个目的，本发明的假单胞菌ZCJ菌株的筛选方法，该方法包括以下的步骤：

1、在100mL生理盐水中，加入10g烟叶(由杭州利群卷烟厂提供)，24～37℃，150～200rpm振荡20～40min；

2、取1mL振荡液加入至100mL富集培养基中，24～37℃，150～200rpm振荡40～50h；

3、取适量富集培养液，涂布在BSM琼脂培养基上，25～37℃下培养35～50h；

4、挑取单菌落，划线在新鲜的BSM琼脂培养基上，获得纯化的菌。