[发明专利]用于荧光定量PCR法检测肠道酿酒酵母菌的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种用于荧光定量PCR法检测肠道酿酒酵母菌的试剂盒。

背景技术

在正常人类肠道中存在一个丰富、多样的真菌群落。人们采用传统的分离培养法已经对人类肠道真菌进行了许多研究(Khatib R，Riederer KM，Ramanathan J，et al.Faecal fungal flora inhealthy volunteers and inpatients.Mycoses，2001，44：151-6.)，该方法通过对真菌表型进行诊断，观察固体培养基上的菌落生长和繁殖情况，根据菌落形状、大小、颜色、粘性以及其他结构特征鉴定真菌，结合不同的生理、生化和耐热性试验等进行形态学诊断。运用分离培养法可以准确的诊断某些致病性真菌，但是，在某些特殊情况下，比如分离培养的菌落形态不典型、特殊培养基无法获取、培养时间过长、表型结果非特异等等，则无法对真菌病原体进行准确诊断，需要依靠非培养诊断技术进行真菌鉴定。

实时荧光定量PCR技术已经广泛应用于微生物的各个领域(Espy MJ，Uhl JR，et al.Real-time PCR in clinical microbiology：applications for routine laboratory testing.Clin Microbiol，2006，Rev 19(1)：165-256.)。该技术不仅能够从本质上增加病原体检测的灵敏度，结合种特异性引物和扩增产物融解曲线分析可以特异的检测和鉴定某种病原体，检测过程无需分离培养，操作简便、快速，极大的缩短了诊断时间；并且可以作为病原体感染患者治疗疗效的监测手段。但是，由于人类肠道微生态群结构复杂，存在大约10¹⁴个不同的微生物有机体，而真菌所占比例较低，不到1％；某些真菌菌种的生长还需要复杂的培养条件，分离培养法只能检测到一小部分条件适合的微生物，检测灵敏度低且诊断周期长。而实时荧光定量PCR技术是基于对病原体核苷酸的检测，不受培养条件限制且检测灵敏度高，有利于更加准确、全面的了解真菌群落在肠道病理生理过程中的作用。利用实时荧光定量PCR技术能够准确、快速的检测和鉴定真菌病原体，这对于及时治疗和有效控制肠道真菌感染都至关重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种用于荧光定量PCR法检测肠道酿酒酵母菌的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

提供一种用于荧光定量PCR法检测肠道酿酒酵母菌的试剂盒，该试剂盒包括：

反应总体积1/10的10×Taqman PCR buffer；

各0.15μmol/L～1μmol/L的上游和下游引物；

各200μmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；

2.0mmol/L～3.5mmol/L的MgCl₂；

0.05U/μl HOTSTART Taq DNA聚合酶；

0.02×SYBR green I荧光染料；

标准阳性模版，其浓度按定量标准曲线制备的要求系列稀释；

余量为无菌双蒸水；

所述两条引物为PCR扩增过程中使用的特异性扩增酿酒酵母菌ITS区的引物：

上游引物序列为：5’-TACTTACCGAGGCAAGCTGCA-3’(SEQ ID NO：1)

下游引物序列为：5’-AGGCGTGCGGTTCTTTG-3’(SEQ ID NO：2)

所述标准阳性模版为酿酒酵母菌标准菌株DNA经前述引物扩增，扩增产物与pGEMT-TEasy载体连接后获得的标准质粒DNA；编码所述扩增产物的基因具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

操作简便、快速；特异性好，灵敏度高；基于对核苷酸的检测，不受培养条件限制；定量检测，能真实反映肠道酿酒酵母菌定植和发生感染的情况；可同时进行高通量的样本检测。本发明提供的试剂盒可对肠道酿酒酵母菌进行快速定量检测，可以替代一直沿用的分离培养的传统诊断方法，并适于在临床实验室广泛推广应用。

附图说明

图1为将本发明试剂盒标准阳性模版梯度稀释后，进行荧光定量PCR扩增所得的动力曲线图，横坐标代表循环数，纵坐标代表相对荧光强度，图中平行于横坐标的直线代表荧光阈值。

图2为将本发明试剂盒标准阳性模版梯度稀释后，进行荧光定量PCR扩增所得的标准曲线图，横坐标代表荧光阈值，纵坐标代表不同稀释度标准阳性模版的浓度。