[发明专利]检测志贺菌的实时荧光PCR试剂盒及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种检测志贺菌(Shigella)的实时荧光PCR试剂盒及其 检测方法。

(二)背景技术

志贺菌(Shigella)作为侵袭性病原菌，可直接破坏肠黏膜，引起细 菌性痢疾和食物中毒。全球每年有1.6亿志贺菌患者，约有110万人死亡。 是我国夏、秋季常见的肠道传染病，也是传染病防制法规定的丙类传染病 病原菌，属于对人类和动物健康有极大危害的一类食源性病原菌。

志贺菌目前主要通过培养法分离，生化方法鉴定，整个过程操作繁琐， 耗时长，阳性率低。TaqMan-MGB探针荧光PCR方法是在荧光定量PCR 技术上发展起来的一种新型实时定量体外核酸扩增检测技术，比后者具有 更好的敏感性、特异性和重复性，而且时间更缩短为2～3h以内。

(三)发明内容

本发明目的是根据志贺菌ipaH基因设计引物和TaqMan探针，提供 一种检测志贺菌的实时荧光PCR试剂盒及检测方法，可实现对志贺菌快 速、准确、特异检测。

本发明采用的技术方案是：

一种检测志贺菌(Shigella)的实时荧光PCR试剂盒，所述试剂盒主 要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和 DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3′

下游引物：5′-CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3′

荧光探针：5′-FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3′

其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。

本发明关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计及检测方法，试剂 盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作志贺菌的定性 检测，也可加入标准菌株标准品进行定量检测。

为达到定量检测的效果，所述试剂盒还包括志贺菌标准菌株 (ATCC51570)的DNA标准品。以梯度浓度的志贺菌标准菌株 (ATCC51570)的DNA溶液在与样品DNA相同条件下进行实时荧光定 量PCR扩增反应，以志贺菌标准菌株(ATCC51570)浓度的对数值为横 坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品测得的Ct值，对照标准曲 线，获得样品中志贺菌的浓度。

本发明应用新型TaqMan-MGB探针，建立的志贺菌实时PCR方法， 可直接检测疑似病人、食品和环境中志贺菌，为志贺菌食物中毒事件快速 诊断，为迅速采取相应措施，避免任何食品来源疾病的爆发提供科学依据。

本发明一种检测贺菌的荧光定量PCR方法，所述方法包括：

(1)按照常规方法提取待测样品DNA；通常采用热裂解法：将菌株 收集于1.5mL管中，置沸水浴10min，10000rpm离心5min，吸 上清至另一离心管，-40℃保存备用；

(2)以待测样品DNA为模板，与特异性引物和荧光探针、PCR缓冲 液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶混合配制PCR反应 体系，进行PCR反应，反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测；

所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3′

下游引物：5′-CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3′

荧光探针：5′-FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3′

其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团；

(3)择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信 号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若 待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，CT 值小于35，则判断为阳性，即样本中存在志贺菌。

所述阴性对照品可按本领域常规方法选择，通常选择不含靶基因的非 靶细菌，如副溶血性弧菌、单增李氏菌、沙门菌等。进一步，所述方法同 时以梯度浓度的志贺菌(ATCC51570)DNA溶液在与样DNA相同条 件下进行实时荧光定量PCR扩增反应，以志贺菌(ATCC51570)浓度的 对数值为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品测得的Ct值， 对照标准曲线，获得样品志贺菌的浓度。