[发明专利]一种含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液及其培养方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种适用于羊胚胎切割后的体外培养的含黄芪多糖的羊 胚胎体外培养液及其培养方法，属于家畜胚胎工程技术领域。

(二)背景技术

胚胎切割是胚胎工程的重要组成部分，是运用人工方法将哺乳动物 附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力的部分，从而获得同卵双生或 同卵多生后代的生物技术。在胚胎数一定的情况下，通过胚胎分割可获 得较多的后代，有助于提高动物的繁殖力，增加羊、羊等单胎动物的双 胎率；同时也是细胞核移植、胚胎嵌合、胚胎性别鉴定、基因导入等研 究工作的基本操作技术，在畜牧生产、实验生物学或医学上均具有重要 意义。虽然通过胚胎切割技术已经获得了活的后代，但胚胎切割后的体 外发育率和移植后的体内发育率较低，限制了胚胎切割技术在实践中的 推广应用。

完整的早期胚胎被切割后，透明带和部分细胞受到破坏是导致切割 后胚胎体外和体内发育率降低的主要原因。目前，羊切割后的半胚一般 在体外做短暂培养后才能移植。胚胎经分割后获得的半胚，可放入M199 等胚胎常规培养液中，在38.5℃、5％CO₂混合空气的培养箱内培养， 使胚胎修复或发育到囊胚期后再进行胚胎移植。为了提高切割胚的成活 率，人们曾致力于体外培养条件的改善，将半胚与输卵管上皮细胞共培 养，但未发现显著作用。胚胎透明带在维持致密化之间胚胎的三维结构 中起着重要的作用，它使胚胎细胞间保持良好的接触，同时保护胚胎细 胞免受胚胎外的免疫细胞等有害因素的影响，并有利于胚胎顺利通过输 卵管。胚胎切割后透明带受到损伤，因此体外培养期间，必须采用一定 措施修复透明带，已证实利用不溶性的琼脂包绕已分割的胚胎，可封闭 透明带上的缺口，使移植后的切割胚胎在生殖道内正常发育，但该方法 操作复杂，不适用于生产中推广应用。Tominaga等在羊的半胚培养液 中加入0.1％或1％的solcolseryl，发现可以提高半胚的成活率。说明培 养条件的改善在一定程度上可以提高切割胚的成活率。

除上述切割时对胚胎透明带和细胞的机械损伤外，氧化应激损伤也 是导致切割胚胎发育率降低的一个重要因素。由于生殖道内氧的浓度为 7％左右，但切割后胚胎的体外培养在约含20％氧气的培养箱中完成， 因此产生了比体内培养时更高的自由基浓度。自由基是细胞内正常代谢 中产生的，在体内正常环境下，自由基的产生和消除处于平衡状态。当 自由基过量或持续产生时，平衡遭到破坏，过量的自由基会损害细胞内 的脂质、核酸以及蛋白质，使有关早期胚胎发育的蛋白质没有得到表达 或蛋白结构受到破坏，因而降低了切割后胚胎的体外和体内发育率。

因此，改善胚胎切割后的体外培养液，以修复胚胎的损伤和缓解氧化 应激损伤是提高切割胚胎体外和体内发育率的重要手段，但目前尚无有效 的胚胎切割修复培养液。

黄芪多糖是从黄芪中提取的一种多糖，具有增强免疫功能、抗肿瘤 作用、保护作用，可提高血中抗氧化相关酶的活性，降低相关组织的过 氧化脂质水平，具有良好的抗氧化作用。对于黄芪多糖的研究已有文献 报道。CN1191358C、CN1262669C、CN1157414C等多种专利申请公 开了黄芪多糖的提取方法。CN1290512C、CN1240393C等多种专利公 开了黄芪多糖用作抗肿瘤、降血脂和保健品的用途。但到目前为止，尚 未见有关黄芪多糖用于家畜繁殖技术领域，特别是用于切割后胚胎体外 培养的报道。

(三)发明内容

本发明即是为了解决现有技术中羊胚胎切割后的细胞及透明带损伤 和切割胚胎体外培养液中自由基过多，导致切割胚胎体外和体内发育率较 低的不足，提供了一种具有及时修复切割胚胎的损伤，清除胚胎胞体内及 培养环境中过量自由基、提高胚胎发育率功能的含黄芪多糖的羊胚胎体 外培养液及其培养方法。

本发明采用的技术方案是：

黄芪多糖在制备羊胚胎体外培养液中的应用。具体的，所述应用如 下：所述的羊胚胎体外培养液以常规培养液为基质，所述基质添加有5～ 100μg/mL(以黄芪多糖纯量计，下同)的黄芪多糖、100IU/mL的青霉素、 100μg/mL的链霉素及5～10mg/mL的血清白蛋白，所述常规胚胎培养液 为人工合成输卵管液或M199、DMEM中的一种。