[发明专利]一种纤维素酶产生菌及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌及其制备和应用，具体为涉及一种纤维素酶产生菌及其筛选及菌种鉴定的方法，所筛选到的细菌其分泌的纤维素酶具有耐高温、耐碱性的特性。 

背景技术

纤维素是世界上最丰富的可再生资源。利用微生物纤维素酶降解纤维素较传统的理化方法具有明显经济、有效、节约的特点，在生物燃料、医药、日用化工、食品发酵、废水处理、工业洗涤、中草药提取等领域都有一定程度的应用。由细菌产生的纤维素酶一般最适pH为中性至偏碱性。近20年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用前景。 

发明内容

本发明的目的，在于提供一种纤维素酶产生菌，以及简便、可靠的纤维素酶产生菌的筛选及鉴定方法，以期简化以往在筛选及传统生理生化法菌种鉴定上的繁琐步骤，所筛选到的纤维素酶产生菌能够产生耐高温、耐碱性的纤维素酶，能被广泛应用于生物燃料、医药、日用化工、食品发酵等多个行业。 

本发明的一种纤维素酶产生菌，所述菌株在地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC NO 3006；保藏日期2009年4月9日，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO1所述；菌株的ITS基因序列如SEQ ID NO2所述。 

上述纤维素酶产生菌的制备方法为： 

(1)用附着于腐烂树根土壤制成的混浊液，在LB液体培养基中，37℃，225rpm，振荡培养过夜；所述LB液体培养基组分为：每100ml蒸馏水中含1g蛋白胨、0.5g酵母粉和1g氯化钠； 

(2)取振荡培养后的产物，用平板接种筛选纤维素酶的产生菌，所用的培养基为：每100ml营养液中含0.5～1.0g羧甲基纤维素钠和1.5～2.0g琼脂；所述营养液的组分按质量体积比为：0.15～0.20％(NH₄)₂SO₄，0.05～0.10％MgSO₄，0.1～0.15％K₂HPO₄和0.05～0.10％NaCl，余量为水，自然pH； 

(3)从筛选的纤维素酶产生菌中选择能够分泌高活性的耐高温、耐碱性纤维素酶的菌株； 

(4)对菌株16S rRNA和ITS基因克隆及序列分析，测序结果进行数据库同源性比较；用于克隆细菌16S rRNA的通用上游引物序列为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，通用下游引物序列为：AAGGAGGTGATCCAGCC；用于克隆细菌16S rRNA和23S rRNA之间的ITS基因的上游引物退火结合于细菌16S rRNA中，序列：CTTGACATCCACGGAAGTTT，下游引物退火结合于细菌23S rRNA中，序列：GTTCTTTTTCACTCCCCTCG。 

本发明所述的纤维素酶产生菌应用于生产纤维素酶。 

本发明利用改良型羧甲基纤维素钠平板与基因工程技术手段，从土壤中筛选并鉴定了一种纤维素酶产生菌，经菌株特性及其分泌的纤维素酶特性分析之后，结果表明，该菌具有耐高温的能力，其分泌的纤维素酶具有耐高温、耐碱性的特点，最终命名该菌为大肠杆菌TCP-1，其16S rRNA和ITS基因序列已登录GenBank数据库，登录号分别为FJ823386和FJ823387。本发明采用的筛选及鉴定方法均具有简便、可靠的特点，所筛选到的细菌及其分泌的纤维素酶有望在生物燃料、医药、日用化工、食品发酵等多个行业中得到广泛应用。 

附图说明：

图1.利用改良型羧甲基纤维素钠(CMC-Na，购自Sigma公司)平板和刚果红染色法筛选纤维素酶产生菌。菌株经划线、挑单克隆菌落继代纯化培养3次后，在CMC-Na平板上接种培养3天，菌落周围出现明显的透明圈。 

图2.利用邻位相连法，绘制出基于几乎完整的细菌16S rRNA基因序列的系统进化树，显示出所筛选菌株TCP-1与数据库中Escherichia coli和Shigella代表菌种的亲缘关系。序列由ClustalX程序进行比对，系统进化树由Phylip软件包(版本号3.68)经1000次重复运算后生成。被比对分析序列的右侧为其碱基对数及其对应的GenBank序列号。