[发明专利]香蕉苞片花叶病毒实时荧光RT-PCR检测试剂及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及检测香蕉苞片花叶病毒的生物制剂，具体涉及香蕉苞片花叶病毒实时荧 光RT-PCR检测试剂及制备方法和应用。

背景技术

香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus，BBrMV)属于马铃薯Y病毒属，病 毒粒子线形，长660～760nm，直径12nm，主要侵染芭蕉属植物。病毒侵染香蕉后， 病叶上沿着叶柄产生深绿色或褐色的梭条斑，而病株花序苞片上则出现黑色斑点，能够 引起香蕉的减产和品质下降。在自然条件下，BBrMV的传播主要依赖蚜虫的非持久性 传播，长距离扩散则随感病植株的无性繁殖材料传播。目前，BBrMV主要分布于菲律 宾和印度等国，在国内未见有分布，是我国新颁布的进境植物检疫性有害生物。

香蕉苞片花叶病毒的检测方法主要包括生物学鉴定、血清学检测和逆转录-聚合酶 链式反应(RT-PCR)技术等。生物学鉴定方法耗工费时，需要隔离温室，检测周期较 长；血清学方法常用的是双抗体夹心酶联检测技术，适用于多样本的初筛，具有操作简 单的优点，但其检测灵敏度较低，且常常由于抗体制备的质量问题而出现非特异性反应。 RT-PCR是用于检测病毒核酸的技术方法，具有较好的敏感性和特异性，但需要进行DNA 电泳等PCR后处理，接触有毒试剂溴化乙锭，易发生交叉污染而造成假阳性结果。

实时荧光RT-PCR(Real-time fluorescent RT-PCR)是近几年发展起来的RT-PCR技 术与荧光检测相结合的方法，其原理是使用能特异标记核苷酸序列的荧光物质，利用荧 光信号的积累实时监测整个PCR过程，具有检测周期短、特异性与灵敏度高以及无需 PCR后处理等优点。以TaqMan水解探针为例，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬 灭基团，通常状态下，荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移现象，荧光基团的荧 光被淬灭基团吸收。当PCR进入退火阶段时，荧光探针特异的结合在两条引物之间， 在延伸阶段被聚合酶的5′端外切酶活性切开。荧光基团与淬灭基团分离，仪器检测出荧 光。荧光PCR仪在反应过程中连续的检测荧光信号的变化，当荧光信号增强到某一阈 值时，此时的循环次数(Ct)就被记录下来。由于荧光信号伴随着PCR模板的扩增而 增长，因此可以根据荧光信号是否增长来确定模板是否扩增。

因此，研究建立特异、快速、可对低含量BBrMV病毒侵染、隐性感染或持续带毒 寄主进行准确检测的方法，在检疫、诊断、分子流行病学研究等方面具有重要的实际应 用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对香蕉苞片花叶病毒具有特异性高、敏感性 强和快速检测的实时荧光RT-PCR检测试剂。

本发明还提供了该检测试剂的制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：系选择香蕉苞片花叶病毒CP编码 基因的保守片段为靶目标，应用primer Express 3.0软件，设计合成引物和探针；将设计 的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最合适的引物和探针。

本发明所述的香蕉苞片花叶病毒实时荧光RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和 一条特异性荧光探针，扩增目标核苷酸序的片段长度为74bp，引物和探针序列为：

引物：BBrMV TF：5′-caaaaactacgaacagggctagaga-3′

BBrMV TR：5′-ccgagtgtttgatccacgaa-3′

探针：5′-FAM-cacacacgcagatgaaagctgcagc-Eclipse-3′。

本发明所述的香蕉苞片花叶病毒实时荧光RT-PCR检测试剂的制备方法，由下述步 骤组成：

一、选择香蕉苞片花叶病毒CP编码基因的保守片段为靶目标，该保守片段的扩增目 标核苷酸序列为：

caaaaactac gaacagggct agagaagcac acacgcagat gaaagctgca 50

gctattcgtg gatcaaacac tcgg                             74

二、应用primer Express 3.0软件，设计合成引物和探针；

三、引物和探针的合成采用β-乙腈磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进 行OligoDNA的合成；