[发明专利]三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因治疗领域，特别涉及一种利用人5型腺病毒(Ad5)骨架来嵌合人11型腺病毒(Ad11)纤维蛋白(fiber)的三靶向嵌合型溶瘤腺病毒载体的构建方法及携带所有具有杀伤、抑制癌症的外源基因如IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1和cpp-SOCS1的应用。

背景技术

恶性肿瘤严重危害人类健康，目前临床上对绝大多数晚期肿瘤患者仍然缺乏有效的治疗手段。当细胞生物学和分子生物学理论与技术得到飞速发展，基因治疗肿瘤策略应运而生。而随着病毒学和肿瘤学快速发展，人们又尝试将改造后的病毒用于肿瘤治疗的研究工作。

癌症的靶向基因一病毒治疗策略是利用溶瘤病毒在肿瘤细胞内特异性裂解、增殖来提高抗癌基因对癌细胞的强烈杀伤作用或抑制作用。这与传统肿瘤基因治疗的病毒载体有本质上的不同，后者是一种非复制性病毒，仅仅作为运载工具将抗癌基因运输到组织或细胞内，而载体本身无靶向性和复制能力也无治疗作用。靶向基因一病毒治疗充分利用病毒体积小、能复制和扩散能力强的优点，可在肿瘤原发病灶和转移灶局部形成高浓度病毒，并激发免疫系统应答来增强杀瘤效应；同时还可以将抗癌基因靶向地运至肿瘤细胞内，抗癌基因能随着病毒的复制而增加拷贝数，提高抗癌基因的表达量，两者协同作用从而进一步提高抗肿瘤的疗

目前作为基因治疗的载体分为病毒型和非病毒型两大类。病毒载体包括：腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、和疱疹病毒等。病毒载体转染率高，表达时间长，但免疫原性强，有一定危险性。非病毒载体包括：裸露DNA、脂质体和其它物质包裹的DNA。非病毒载体则免疫原性小及安全性好，但转染率低，基因稳定性差，表达时间短。目前使用最多还是病毒载体。而在众多病毒载体中腺病毒以其宿主范围广，致病性低，包装容量大，产生滴度高等优点成为应用最广的基因治疗载体。根据http://www.wiley.co.uk/genmed的最新统计，全球共有1145个基因治疗方案进入临床，其中67％用于癌症的治疗，而以腺病毒为载体的研究最为广泛且高达25％。

而关于5型腺病毒(Ad5)的研究已经进行了很长的时间，对其所具有的特点及安全性均一定的了解和认识，目前腺病毒基因治疗仍以Ad5为主导。由于Ad5对细胞的感染效率高度依赖于细胞表面柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsakieand adenovirus receptor，CAR)的表达水平，但在近50％的上皮细胞源性的肿瘤细胞表面CAR非常缺乏，甚至在血液肿瘤细胞表面几乎不表达，这就使得腺病毒对这些肿瘤细胞感染效率低下，甚至对血液系统肿瘤无感染能力。这一特性限制了其在上皮细胞源性的肿瘤细胞和血液肿瘤细胞的治疗中的应用。因此再此基础上研制高效、靶向转染肿瘤细胞的载体系统对目前肿瘤的基因治疗至关重要。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体的构建方法及其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体的构建方法，该方法是以双靶向溶瘤腺病毒载体pCN103和pCN205做为基础，通过将5型腺病毒Ad5的骨架与人11型腺病毒Ad11的纤维蛋白fiber进行嵌合并利用端粒酶逆转录酶hTERT启动子来调控缺失了CR2区与Rb蛋白结合所必需的24bp的E1A基因。

进一步地，该方法具体包括以下步骤：

(1)通过PCR的方法，将人11型腺病毒的Fiber基因装载于穿梭质粒p11zf-ad5-ad11p。

(2)通过同源重组的方法将人11型病毒Fiber基因替换pCN103骨架质粒中的5型病毒Fiber基因。

(3)用酶切连接的方法构建E3区缺失6.7K和gp19K基因的载体质粒pCN204；

(4)将所有具有杀伤和抑制各类癌症的外源基因如IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1和cpp-SOCS1克隆进pCN204的多克隆位点，构建成质粒pCN204-IL-24。

(5)将质粒pCZ204-IL-24通过酶切和片段回收后，电转化在BJ5183同源重组，获得三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体，命名为pCN205-11p载体。