[发明专利]抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程抗体，涉及一种抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体及其在预防性被动免疫和慢性乙型病毒性肝炎潜在的治疗药物开发中的应用。

背景技术

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率很高，据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者(HBsAg携带者)超过3亿，我国约占9300万。乙肝病毒携带者中1/3会转为慢性肝炎，10％的慢性肝炎患者会发展为肝硬化，10％的肝硬化患者会进一步发展为肝癌。因而乙型病毒性肝炎是一种流行极广，危害极重而且没有有效治疗方案的传染病。虽然主动的疫苗接种可以有效地预防乙肝，但是绝大部分的人群并没有接受疫苗接种，因而这些人群仍然暴露于乙肝病毒感染的高度危险之下。中和性的乙肝病毒免疫球蛋白可以有效预防母亲为乙肝患者的新生儿、意外暴露于乙肝病毒的成年人免受乙肝病毒的感染，有效预防肝硬化或肝癌患者肝移植后乙肝的复发，有效控制爆发性肝炎患者体内乙肝病毒的大量繁殖和扩散；而且由于抗体可以介导抗体依赖的、细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体介导的细胞毒性作用(CDC)，所以对于慢性肝炎患者以及乙肝病毒携带者具有潜在的治疗作用。然而，目前临床上用到的乙肝病毒免疫球蛋白都是从接受乙肝疫苗接种的正常人血清中分离出来的，属于血液制品，因而具有传播某些血液传播感染性疾病的潜在危险，如艾滋病，丙肝，所以它的应用价值受到了很大的限制。而通过抗体库技术获得的重组中和性乙肝病毒抗体就可以克服这一缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的、具有中和活性的、人源性单链抗体，能用来预防、控制和治愈乙肝病毒的感染。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体，该单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

作为本发明的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体的改进：抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

作为本发明的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体的进一步改进：该抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

本发明还提供了上述抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体在制备预防性被动免疫药物中的应用。

本发明还提供了上述抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体在制备治疗慢性乙型病毒性肝炎药物中的应用。

噬菌体抗体库技术无需经过杂交瘤，可以从接受乙肝疫苗接种后具有高滴度保护性乙肝抗体的正常人外周血中分离淋巴细胞，进而扩增出全部抗体基因并建成噬菌体展示抗体库，从中筛选出高亲和力的抗乙肝病毒a决定簇的中和抗体。研究表明，乙肝表面抗原中的a决定簇介导乙肝病毒与肝细胞表面的受体结合并感染，所以抗a决定簇的抗体具有中和活性。

本发明采用噬菌体表面展示技术，从3位接受乙肝疫苗接种后具有高滴度保护性抗体的正常人外周血单个核细胞提取mRNA并从中扩增出人的全套抗体可变区基因，然后装配成单链抗体基因片段，克隆到噬粒载体并转化大肠杆菌构建成一个3×10⁹的人源性单链抗体库。然后用乙肝病毒表面抗原a决定簇的重组蛋白进行筛选得到其特异性的高亲和力中和性抗体。该抗体可在大肠杆菌中可溶性表达，该抗体编码243个氨基酸，序列如SEQ ID NO：1所述。本发明的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体由729个核苷酸组成，其序列如SEQ ID NO：4所述。

本发明的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体的重链可变区基因编码120个氨基酸，序列如SEQ ID NO：2所述。该抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体重链可变区由360个核苷酸组成，其序列如SEQ ID NO：5所述。本发明的抗乙肝病毒表面抗原a决定簇的人源性单链抗体重链可变区由IGHV4-4，IGHD6-19和IGHJ4基因重排后形成的具有单一开放读框的功能性可变区基因。其中CDR3(互补决定区3)的核苷酸序列为GTT GGGCCC CAG TGG CTG GTA CCC AGG，氨基酸序列为V G P Q W L V P R，由IGHD6-19和本发明的乙肝表面抗原a决定簇的特异性人源性单链抗体特有的序列组成。