[发明专利]镍离子人工抗原螯合剂的合成及镍单克隆抗体的制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的双功能螯合剂及该螯合剂在重金属镍离子人工抗原的合成及镍单克隆抗体制备中的应用。

背景技术

人工抗原的合成是重金属免疫分析技术中关键环节之一，它是利用双功能螯合剂先与重金属离子形成稳定的螯合物(半抗原分子)，再与载体蛋白质偶联形成重金属-螯合剂-载体蛋白质的螯合物(人工抗原)。目前双功能螯合剂的种类非常少，并且价格偏高，阻碍了重金属人工抗原合成的研究。本申请人曾在先申请了镉离子人工抗原螯合剂的合成方法，继而介绍了对应的镉离子人工抗原和单克隆抗体的合成，并将抗体应用于镉离子污染的检测，但对于重金属镍而言，目前国内并没有关于制备其人工抗原的相关报道，因此，寻找新型、价廉的双功能螯合剂，并进一步制备相应的人工抗原和单克隆抗体，对应用于重金属镍残留污染的快速检测具有十分重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明的目的是研制出一种双功能的镍离子人工抗原螯合剂6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉(6-bromine acetamido-2，3-(N，N，N′，N′-tetraacethyl)dimethylamino-quinoxaline，BATDQ)合成对应于重金属镍的人工抗原，并公开基于此人工抗原的重金属镍单克隆抗体的制备方法，以及运用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)中的间接竞争法检测富含镍离子污染的样品。

本发明的目的通过如下措施实现：

1.镍离子人工抗原螯合剂的合成方法如下：

1)6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉的合成：

将2g 4-硝基邻苯二胺和1.13g丁二酮放入250mL单口烧瓶中，以50mL无水乙醇为溶剂，加热回流2h，冷却至室温后抽滤，加30mL无水乙醇结晶提纯，所得产物即为6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉；

2)6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的合成：

取0.5g第一步产物6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉、0.202g偶氮二异丁腈与1.14g N-溴代琥珀酰亚胺置于干燥的250mL单口圆底烧瓶中，再取40mL四氯化碳加入烧瓶中，装上回流冷凝管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到80℃的油浴中，强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，待反应完毕后，将混合物冷却至室温再过滤，取滤液放入水浴锅中蒸馏、冷却，得6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉；

3)6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：

在装有机械搅拌、回流冷凝管和恒压漏斗的三口烧瓶中，加入1.99mL亚氨基二乙酸二乙酯、10mL干燥的乙腈和2.63g无水碳酸钾粉末；搅拌下向反应混合液中滴加溶有1.805g 6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的10mL干燥乙腈，回流8-10h，冷却，滤去碳酸钾，滤液减压下旋转蒸发回收溶剂，得淡黄色油状液体；往上述油状液中加入含3.48g结晶氢氧化钡(Ba(OH)₂·8H₂O)的饱和溶液，室温下充分搅拌至油状液体均转化为白色沉淀，抽滤钡盐并用蒸馏水充分浸泡、洗涤；然后将此钡盐转移到15mL蒸馏水中，将混合物加热煮沸，加入硫酸至清液中不再出现混浊，过滤除去硫酸钡，再用沸水煮洗硫酸钡残渣3次，将滤液和洗涤液合并，冰箱中冷却8-10h，得到6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；

4)6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：

将100mL乙醇和2.025g 6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉加入到250mL装有温度计、机械搅拌器的三口瓶中，加入1.2g钯碳催化剂和5.29g水合肼，不断搅拌，在80-85℃条件下反应4h后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷却后所得固体用50mL苯重结晶，得到6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；

5)6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：