[发明专利]一种肝癌靶向性基因表达元件AP及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术，涉及基因表达调控，具体地说，涉及一种特异性针对 甲胎蛋白阳性肝癌的靶向性基因表达元件AP的设计、制备及其在甲胎蛋白阳 性的肝癌细胞内特异表达、其转录产物经细胞内加工后可以有效地抑制肝癌细 胞内DNA聚合酶的表达，使细胞内DNA复制因DNA聚合酶 缺乏而无法 进行，从而达到抑制肝癌细胞增殖的作用。本发明可用于制备靶向性肿瘤基因 治疗药物。

背景技术

恶性肿瘤是目前人类主要“杀手”之一，近年来随着人们生活方式及环境的 改变，其发病率呈上升趋势，在许多城市已成为第一位死亡原因，在农村位列 第二位。肝癌在我国是最常见的危害极大的恶性肿瘤之一，和肺癌、胃肠道肿 瘤、乳癌等其它常见恶性肿瘤相比，目前的手术和化疗等常规方式的疗效和预 后均不理想。

被称为肿瘤治疗新模式的生物治疗目前正显示出越来越良好的应用前景。 在各种肿瘤生物治疗手段中，基因治疗始终是一个主要方向，我国研制的世界 上第一个正式进入临床使用的基因药物、针对许多肿瘤细胞中发生突变的抑癌 基因p53的、可表达野生型p53的腺病毒注射液“今又生”即是其代表。随着医 学分子生物学技术和知识的飞速发展，各种先进的分子生物学手段都运用到肿 瘤的基因治疗研究中。但是由于肿瘤的发生发展涉及众多基因，而目前的研究 大都仅针对个别靶基因，因此，这些研究虽然都显示出较好的细胞水平的体外 抑瘤效果甚至荷瘤动物模型的体内抑瘤效应，但实际效果并不理想。因此，探 索、尝试新的肿瘤基因治疗手段具有十分重要的意义。

正常细胞在各种致癌因素的作用下逐渐发生变化直至最后发生癌变，有相 当多的基因表现出过度表达的现象，尤其是一些促进细胞生长、侵袭等恶性表 型的基因的过量表达。针对肿瘤中异常表达的基因，人们设计了许多靶向性基 因治疗的方法，其中以封闭促进肿瘤生长、侵袭等相关基因的表达的研究是一 个相当热门的领域。在以往大量的研究中，人们利用反义RNA(antisense RNA) 对肿瘤细胞高表达基因进行封闭，但由于反义RNA本身存在的限制，这类研 究在抑制肿瘤细胞生长、控制细胞侵袭迁移等方面虽然取得了较大的成绩，其 封闭基因表达的效果仍不理想。

小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的发现为人为干预细胞中基 因的表达提供了一个有力的工具。利用化学合成的双链形式的siRNA，或是由 III型启动子带动转录的结构类似的小发卡样RNA(small hairpin RNA， shRNA)，可以通过序列特异性匹配原则降解靶基因，从而对靶基因的表达进 行有效的抑制，因此也被尝试应用于基因治疗。但是由于化学合成的siRNA代 价太高，而shRNA的表达又不利于调控，这些因素大大地限制了这一技术的 应用。

微小RNA(microRNA)是细胞内天然存在的一种小分子RNA，是在基因 转录后水平进行表达调控的一种重要方式，能在序列完全匹配的情况下降解靶 基因mRNA，也可以在序列非完全匹配的情况下抑制靶基因的翻译，是目前生 命科学领域中的一个研究热点，在肿瘤相关microRNA方面也有大量研究，而 且大都集中在正常细胞和肿瘤细胞之间表达有差异的各种天然microRNA的发 现以及功能鉴定。

由于天然microRNA是由II型启动子带动转录，因此如果人工设计类似的 microRNA分子，也应该可以由II型启动子引导转录，而II型启动子的特点是 其转录启动功能可以调控，所以其下游的人工miRNA的表达应该可以受到人 为控制，而microRNA的作用方式最近的一些文献报道已证实这一设想。

在本发明中我们选择细胞周期中的DNA复制这一重要环节为靶点，设计 人工microRNA的序列，抑制DNA复制中的关键酶的表达，通过阻断DNA复 制而使细胞周期停止。由于DNA的复制是一个复杂而又精密调控的过程，主 要由DNA聚合酶、和等酶催化、以原有的DNA链为模板进行的半保 留复制，因此对DNA聚合酶 的抑制将有效阻断细胞的DNA复制，从而使 细胞周期因DNA无法复制而停止，进而抑制细胞的增殖。