[发明专利]以家蚕作为宿主生产重组蝎毒素蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组技术、杆状病毒基因表达系统、蛋白质的纯化与活性分析，尤其涉及一种利用家蚕作为宿主生产重组蝎毒素蛋白的方法。 

背景技术

蝎毒素蛋白BmK是一种由蝎合成、分泌的小分子量蛋白质，基因长度为198个核苷酸，编码65个氨基酸，pI为6.3，预测分子量大小8KDa左右，具有较强的毒性。蝎毒素具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤、消炎、通络、祛风湿、镇痉安神、止痛等功能。因此，蝎毒素具有较好的应用价值，显示出很好的应用前景。但是目前市场上蝎毒素蛋白的价格较贵，虽然用基因工程的方法在大肠杆菌中可以生产，但在大肠杆菌中蝎毒素以包含体的形式表达，需要对其重新折叠恢复其生物活性。额外的处理使得该过程效率很低且不经济。为了克服这个问题，其他曾试着用酵母和腺病毒感染的哺乳动物细胞进行表达生产。然而，酵母的质粒转化体不稳定，哺乳动物培养细胞生产的成本又太高。因此有必要建立一种高效经济的生产蝎毒素的方法。 

杆状病毒表达系统是当今最有效的真核基因表达系统之一，目前该系统主要包括欧美国家正在广泛应用的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornica nuclear polyhedrosis virus，简称AcNPV)和以中国、日本为代表的家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，简称BmNPV)表达系统两大类，两者各有优点，但病毒寄主范围不同，AcNPV寄主范围较广。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用家蚕作为宿主生产重组蝎毒素蛋白的方法。 

本发明的发明构思是利用BmNPV构建含有蝎毒素基因的重组病毒，并利用家蚕作为宿主，使用“家蚕-重组杆状病毒表达系统”表达生产具有生物活性的重组蝎毒素。 

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是该以家蚕作为宿主生产重组 蝎毒素蛋白的方法主要包括如下步骤： 

(1)以蝎cDNA为模板、以含有BglII酶切位点的5′-ACGTAGATCTATGGATGGATATATAAG-3′为正向引物、以含有BglII酶切位点的5′-ACGTAGATCTTTACTTTTTTCCAC-3′为反向引物进行三十二个循环的PCR基因扩增反应获得蝎毒素基因，所述PCR基因扩增反应的第一个循环是在94℃模板变性50秒；第二个至第三十一个循环是先在55℃退火30秒，后在70℃延伸30秒；第三十二个循环是在70℃延伸7分钟； 

对PCR基因扩增反应获得的蝎毒素基因进行纯化，并将该蝎毒素基因克隆入3.9kb载体pCR2.1得到pCR2.1-蝎毒素，在核苷酸测序仪上测序确认pCR2.1-蝎毒素基因顺序的正确性； 

(2)用限制性内切酶BglII消化pCR2.1-蝎毒素得到蝎毒素基因片段，然后将蝎毒素基因片段克隆入杆状病毒转移载体pAcGP67b获得重组体pAcGP67b-蝎毒素基因； 

通过共转染在Sf 21培养细胞内与家蚕杆状病毒BmNPV DNA同源重组产生重组病毒，所述共转染的方法为：先将1μg pAcGP67b-蝎毒素基因DNA和15μgBmNPV DNA混合，接着加入14μl脂质体lipofectin，后又加入灭菌蒸馏水至终体积40μl，最后将该混合液在室温培育15分钟后共转染对数生长期的Sf21培养细胞； 

将上述通过共转染产生的重组病毒先用无血清的TC-100培养基培养24小时，再换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基于27℃培养5天后，收集培养基上清液作为病毒原液以用来筛选所述重组病毒；重组病毒通过3轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的重组BmNPV-蝎毒素病毒溶液，该BmNPV-蝎毒素病毒溶液的浓度为10⁸pfu/ml； 

(3)先将5龄家蚕幼虫浸在冰水浴中进行麻醉，然后采用皮下注射的方法将浓度为10⁶pfu/ml的重组BmNPV-蝎毒素病毒悬浮液注射入家蚕幼虫进行感染表达，每条家蚕注射20μl；注射1小时后对家蚕幼虫喂桑，并在23-25℃下饲养；