[发明专利]基于组织工程方法构建新型高效生物催化剂

权利要求书

1.基于组织工程方法构建新型高效生物催化剂，其主要步骤为：

a)三维多孔支架的制备

用适当溶剂将组织工程支架材料和适量致孔剂微晶(水溶性无机盐)制成均匀的混合物，加入到多孔培养板中，风干成胶后，用去离子水浸出微晶制成直径5～10mm、厚度3～6mm的三维多孔支架。

b)细胞接种于三维多孔支架培养

先将上述支架浸泡于一定浓度培养基或麦芽汁中并过夜。将种子细胞经扩大培养后按一定量接种到支架上，置于1～50℃水浴摇床轻微振荡1～200分钟后，将其移入多孔培养板中，再置于培养箱中在4℃～40℃培养1～10天，制得组织工程细胞片。

c)对组织工程细胞片进行凝胶包衣

取一定量的聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠加热至完全溶解，制成PVA和海藻酸钠的混合液。冷至室温。将制得的混合液滴于多孔板中的组织工程细胞片表面，放入包衣机中冷风吹5～120分钟至表面胶化；翻转组织工程细胞片后，再在其表面再滴上上述混合液，放入包衣机中开冷风吹5～120分钟至表面胶化。将凝胶包衣片从多孔板中取出，放入一定浓度CaCl₂溶液中搅拌3～180分钟。洗净表面的CaCl₂。反复冻融，增加包衣层机械强度。制得组织工程细胞凝胶包衣片。

d)凝胶包衣层脱钙致孔

把组织工程细胞凝胶包衣片放在一定浓度磷酸盐或柠檬酸或EDTA溶液中振荡一定时间，使凝胶层中的海藻酸钙溶解形成微孔通道，便于物质传输。

e)透性化

将上述形成微孔通道后的组织工程细胞凝胶包衣片，放在十六烷基三甲基溴化铵溶液(CTAB)或甲苯或乙醇混合溶剂中，在4～40℃处理2～120分钟，使细胞透性化，增加凝胶包衣片中细胞的酶活性。制得透性化组织工程细胞凝胶包衣片这种新型高效生物催化剂。液体环境：

所述PVA水溶液在0.01％～15％(W/V)；

所述海藻酸钠浓度在0.01％～6％(W/V)；

所述CaCl₂溶液浓度在0.1％～20％(W/V)；

所述的磷酸盐或柠檬酸或EDTA浓度为0.01～1mol/L；

透性化处理所用CTAB或甲苯或乙醇混合溶剂溶液为0.01％到8％；透性化时间为1～60分钟。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a)中所述的组织工程支架材料为天然材料如丝素蛋白、胶原蛋白、明胶、海藻酸(盐)、壳聚糖、琼脂糖等，人工合成材料如脂肪族聚酯、聚酸酐、聚乳酸等共聚物以及无机材料如羟基磷灰石等；所用溶剂为水、酸溶液、碱溶液、有机溶剂；致孔剂微晶采用粒径50～1000微米氯化钠等水溶性无机盐，其用量为：组织工程支架材料∶无机盐＝1∶1～1∶10。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b)中所述细胞为酵母或其它真菌细胞，或细菌和基因工程改造过的微生物细胞等，质量分数2％～80％。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c)中所述的冻融条件为-80℃～0℃，1～10次，每次1～24小时。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d)中在磷酸盐或柠檬酸或EDTA溶液中振荡，凝胶层打孔1～80分钟。利用凝胶层海藻酸钙对磷酸盐溶液或其它钙离子络合剂化学侵蚀的敏感性，通过化学侵蚀将细胞支架片上凝胶中的藻酸盐部分溶解，从而形成空穴，以提高在用生物催化剂催化剂进行生物催化反应时原料和产物的传输效率。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e)中，用CTAB、甲苯或乙醇混合溶剂进行透性化处理，从而提高细胞内的酶活性。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于使用后的支架，经过去掉包衣层，洗净细胞后，可以再经过要求1中所述的步骤从b)、c)、d)到e)所述处理，重复应用。