[发明专利]一种无假阳性T载体及制备方法

权利要求书

1、一种无假阳性T载体，其是一种两个3’端均具有1个突出的dT的线性化质粒载体，所述 T载体用于T-A克隆时，即使T载体自连也不会因阳性克隆筛选标记基因移码而产生假阳性 克隆；其特征在于：所述T载体供插入3’端突出一个dA的PCR片段的位点，即线性化T 载体的两个末端，位于阳性克隆筛选标记基因起始密码子与其上游的核糖体结合位点之间。

2、制备权利要求1所述无假阳性T载体的方法，其特征在于：

(1)在通用克隆载体的阳性克隆筛选标记基因起始密码子与其上游的核糖体结合位点之 间通过定点突变引入一个单一的平末端酶切位点，即得所述T载体的前T载体；

(2)用相应内切酶在该位点切开所述前T载体，然后用Taq DNA聚合酶在只有dTTP 为底物的条件下在已线性化的前T载体的两个3’端添加一个突出的dT即可制备所述无假阳 性T载体。

3、制备权利要求1所述无假阳性T载体的方法，其特征在于：

(1)设计并人工合成一段DNA片段，该DNA片段的序列具有下述特征：a.该序列含 有两个有一定间隔的、串联的Xcm I内切酶位点；b.上游的Xcm I位点的切点前最后一个核 苷酸为T，下游的Xcm I位点的切点前最后一个核苷酸为A；c.这两个Xcm I位点序列内切 点前的序列中分别包含一个相同的核糖体结合位点；d.上游Xcm I位点序列的后八个核苷酸 序列是下游Xcm I位点序列的前八个核苷酸序列的反向互补序列；在通用克隆载体的阳性克 隆筛选标记基因的起始密码子与其上游的启动子之间引入上述合成DNA片段即得所述T载 体的前T载体；

(2)用Xcm I在这两个位点切开所述前T载体，纯化回收线性化的载体大片段即可制备 所述无假阳性T载体。