[发明专利]粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种蛋白编码序列，特别是一种粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列，属于基因工程领域。

背景技术

粘毛黄芩属于唇形科黄芩属多年生药用草本植物。该属植物约300多种，世界广布，我国有100种以上，可作为黄芩药用者约有7种左右，粘毛黄芩就是其中的一种。该植物主要药用成分为黄芩苷，现代药理学证实其具有清热解毒、止血安胎、抗菌消炎、保肝利胆、降压脱敏、防晒美白等作用。随着国际上对黄芩苷等研究的持续升温和认识的逐步深入，认为黄芩苷在清除氧自由基、减轻组织的缺血再灌注损伤、调节免疫、促进细胞凋亡以及抗肿瘤和HIV等多方面均有作用(Hwang，et al，2005)，具有重要的药用价值和开发利用前景。然而目前获得粘毛黄芩的主要技术是人工栽培，但存在生产周期长、成活率低、农药残留超标和有效成分较低等弊端，使得该方式商业前景尚不明朗。因而，寻找新的药源十分必要。植物次生代谢途径分子生物生物学的飞速发展和植物生物技术的日趋成熟，使得利用基因工程获得粘毛黄芩中重要的天然药物黄芩苷成为可能。

基因工程技术是实现遗传改良和种质创新的重要方法，开展黄芩苷代谢工程研究，进而获得高产优质的新型药源，而前提是阐明其生物合成的分子机理，即分离该途径上多个酶促反应步骤的基因，并考察目的基因在黄芩苷生物合成途径中的作用，为黄芩苷的代谢工程提供候选基因和作用靶点十分必要。黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase，F3H)是黄烷酮分支点的一个核心酶，它的作用是催化5，7，4’-黄烷酮C3位的羟化，生成二氢山奈素(dihydrokaempferol，DHK)，而DHK则是合成黄烷酮和花色素的重要中间产物(Timothy et al.，1995)。因此F3H是黄酮化合物生物合成途径上的一个关键酶，也是控制黄酮合成与花青素苷合成的分流位点。1991年，f3h基因首次从金鱼草中克隆出来，目前已从拟南芥(Arabidopsis thaliana)、苜蓿(Medicago sativa)和玉米(Zea mays)中被陆续分离鉴定。通过调控f3h基因的表达能够有效调节植物花卉或种皮的颜色，针对该基因的遗传操作已成为花色变异育种研究的重要手段；另一方面通过反义抑制f3h基因从而阻断花青素合成途径，使通用前体柚皮苷更多地流向目标代谢产物黄酮和异黄酮，该策略已被证明F3H是黄酮代谢工程的重要靶点。由此可见，f3h是黄酮生物合成途径上重要的调节基因，其催化的反应是黄酮合成调控的关键步骤。可以推断，要提高粘毛黄芩中黄芩苷的含量，F3H将会是一个很有效的代谢工程靶点，然而遗憾的是，到目前为止，还未见从粘毛黄芩中克隆和鉴定f3h基因的报道。根据GeneBank中黄烷酮3-羟化酶的核苷酸序列，结合PCR技术我们从粘毛黄芩中克隆了相关序列，根据GeneBank的搜索结果，将该基因命名为黄烷酮3-羟化酶基因。

在对现有文献的分析中，未见粘毛黄芩黄酮类化合物生物合成途径上的f3h基因的克隆，至今尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列。本发明公开了粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶的氨基酸序列以及粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因的核苷酸序列，为最终采用打破黄酮类化合物生物合成途径上的限速反应步骤，实现黄芩苷的代谢工程提供候选基因和作用靶点，并其在利用转基因技术提高黄芩苷等黄酮类化合物的含量方面的应用奠定了基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

在本发明所分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第74-1123位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45—55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第74-1123位的核苷酸序列杂交。

本发明所分离出的粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列多肽，它包括：具有SEQID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。

本发明所提供的一种载体，它包含上述的DNA分子。一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

本发明用上述载体转化的宿主细胞是真核细胞。