[发明专利]肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及一种肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒，还涉及该试剂盒的检测方法。 

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，近年来发病率呈逐年上升趋势。化疗是根治恶性肿瘤、防止其转移和复发的有效手段之一，但随着抗肿瘤药物的广泛应用，肿瘤耐药问题日益突出，已成为肿瘤有效治疗的主要障碍之一。根据肿瘤细胞的耐药特点，肿瘤耐药可分为原药耐药(PDR)和多药耐药(MDR)两类。PDR只对诱导的原药产生耐药而对其他药物不产生交叉耐药。MDR是由一种药物诱发，但同时又对其它多种结构和作用机制迥异的药物产生交叉耐药。统计数据显示，90％以上肿瘤患者的死因都与MDR有关。因此，逆转MDR成为肿瘤治疗亟待解决的问题。 

在MDR发生机制中，目前研究最广泛的是膜转运蛋白，其可以将药物泵出细胞，使细胞内药物浓度低于治疗浓度，或者可以将药物在细胞内重新分布，使药物远离作用靶点，从而导致耐药。已知与MDR有关的膜转运蛋白包括p-糖蛋白(p-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)和肺耐药蛋白(LRP)等。 

p-gp由1200个氨基酸组成，定位于7号染色体q21.1带上的MDR1基因，共有12个跨膜疏水区和2个ATP结合位点，在膜内以二聚体或四聚体的方式存在。这种跨膜结构具有能量依赖性“药泵”的功能，能将抗肿瘤药物和其它疏水性化合物主动转运出细胞，其底物包括蒽环类、长春碱、表鬼臼毒素、紫杉醇和其它天然抗肿瘤药物。p-gp在正常胆管、肾、小肠、肾上腺、 造血干细胞等均有表达，负责激素运输及排泌毒物等生理功能，当正常细胞演变成恶性细胞时，p-gp仍继续表达，因此，临床上来源于这些组织的肿瘤，对初始化疗就具有耐药性。而食管癌、胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌和造血系统恶性肿瘤等则属化疗前p-gp低表达的肿瘤。p-gp高表达的肿瘤患者常伴预后不良，如低缓解率、高复发率、生存期短，可作为预后评价指标。 

MRP由1531个氨基酸组成，定位于16号染色体p13.1带上的MRP基因。MRP至少有四种亚型，其中MRP1在正常组织及肿瘤组织中广泛存在，是引起MDR的主要因素之一。耐药的发生是由于依赖ATP的谷胱甘肽S结合载体活性提高的缘故，谷胱甘肽S结合的输出载体又称为“GS-X泵”，它可将阴离子的共轭物排泄出细胞，并在清除外源性毒素中发挥作用，MRP能介导药物中的谷胱甘肽硫共轭物、葡萄糖醛酸甙共轭物和硫酸盐共轭物排出细胞。此外，MRP不但定位于血浆细胞膜，而且存在于内质网、高尔基滤泡处，提示MRP还可在细胞内隔离药物，使药物不能与靶位点结合，从而间接导致耐药。由MRP介导的耐药谱包括紫杉醇、米托蒽醌、蒽环类、长春碱、表鬼臼毒素等。文献报道的由MRP机制引起MDR的肿瘤包括乳腺癌、宫颈癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、食管癌、纤维肉瘤和神经母细胞瘤等。 

LRP由896个氨基酸组成，定位于16号染色体上的LRP基因。LRP广泛分布于正常组织和肿瘤细胞中，其介导耐药非常广泛，包括一些p-gp和MRP不能介导的药物的耐药，如铂类、烷化剂等。LRP可通过两种途径引起MDR：一是封锁核孔，使药物不能进入细胞核；二是使进入细胞内的药物转运至胞质中的运输囊泡，呈房室分布，最终经胞吐机制排出。 

目前，MDR的检测主要是采用流式细胞术、Western Blot和免疫组化等方法检测p-gp、MRP1和LRP等相关蛋白，但上述方法存在操作繁琐、不易标准化和检测费用高等问题，在临床应用上受到一定局限。近年来，以荧光 定量PCR为代表的基因扩增技术迅速发展，在检测临床病原体等方面发挥了重要作用。因此，开发一种操作简单快速、易标准化、检测费用低的MDR相关基因检测方法具有良好的应用前景。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒，能够灵敏、特异、准确地同时检测多种肿瘤多药耐药相关基因。 

为达到此目的，本发明提供了一种肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组成部分： 

a、MDR1基因标准品：含有MDR1基因编码序列的重组载体； 

b、MRP1基因标准品：含有MRP1基因编码序列的重组载体； 

c、LRP基因标准品：含有LRP基因编码序列的重组载体； 

d、内对照GAPDH基因标准品：含有GAPDH基因编码序列的重组载体； 

e、检测MDR1基因的上、下游引物和荧光探针：