[发明专利]基于Vasohibin基因的伪病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及基于Vasohibin基因的伪病毒及其制备 方法和应用。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率疾病。继手术、放射治疗 和化学治疗后，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗中的重要手段。当前，肿瘤生 物治疗策略有肿瘤相关基因或肿瘤抑制基因的靶向治疗、肿瘤相关抗原的免疫 治疗等，但均由于技术成熟性、有效性、安全性和经济性等问题，在实际应用 中受到很大限制。

研究发现，90％以上的人类肿瘤为实体瘤，而实体瘤的生长和转移需要新生 血管形成，抑制新生血管形成能够在一定程度上有效抑制肿瘤的生长和转移。 因此，抑制肿瘤血管生成成为肿瘤治疗中一个重要的补充策略。过去十年中， 国内外研究者致力于各种肿瘤血管生成抑制剂的研究，但迄今为止尚未取得令 人满意的效果。此外，研究还发现，单纯抑制肿瘤血管生成在肿瘤治疗中仍存 在一定局限性，若同时联用针对肿瘤细胞本身的其它治疗手段，将会产生更加 理想的抗瘤效果。因此，以肿瘤新生血管内皮细胞和肿瘤细胞为双靶标的治疗 策略成为肿瘤研究中的一个新方向。

Vasohibin是新近发现的第一个血管生成负反馈调节因子，选择性表达于血 管内皮细胞，可以被血管生成促进因子如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、纤 维生长因子-2(FGF-2)等诱导产生，并通过负反馈调节抑制血管生成。研究显 示，Vasohibin基因转染至小鼠肝组织中可使血浆中Vasohibin释放增加，并在 远隔部位表现出抗血管生成效应；在小鼠视网膜新生血管生成模型中，血管内 皮细胞VEGF高表达与Vasohibin mRNA升高相伴行，敲除Vasohibin基因后导 致视网膜新生血管增加，相反，眼球内注射重组Vasohibin基因或带有Vasohibin 基因的腺病毒载体能强烈抑制视网膜新生血管形成；通过腺病毒载体转染 Vasohibin基因还可以抑制人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和微管形成等。因此， Vasohibin可能是抑制肿瘤血管生成的理想靶点。

RGD肽是一类含有Arg-Gly-Asp(RGD)序列的小肽，广泛存在于多种生物 体内及同一种生物体的各种组织中。作为一种重要的细胞识别位点与信号启动 分子，在许多生命活动中发挥着重要的调节作用。目前研究较多的是关于RGD 肽通过其所含的RGD序列竞争结合到细胞表面的整合素受体上从而产生抗血小 板凝聚、抗肿瘤迁移以及抗肿瘤血管生成作用等方面。研究证实：整合素家族 中α_υβ₃与细胞粘附和新生血管形成的关系最为密切，其配体RGD肽对肿瘤新生血 管内皮细胞的粘附和迁移有明显抑制作用，且可诱导肿瘤细胞中caspase-3和 caspase-7表达增高，从而促进肿瘤细胞的凋亡。

人类乳头状病毒16型(Human Papillomavirus type-16，HPV16)的主要衣壳 蛋白(L1)具有自身装配成病毒样颗粒(Virus-like Particle，VLP)的特性，而 在适宜条件下VLP可以将外源基因或小分子物质包装成具有天然病毒样结构的 伪病毒(Pseudo Virus)，因此，HPV16L1可以用作基因或药物载体。但HPV16L1 VLP具有较强的免疫原性，免疫动物时能诱导机体产生高滴度的中和抗体，不利 于目的基因高效转染至靶细胞中。研究发现，HPV16L1 VLP与中和抗体产生及 结合有关的构象依赖性抗原表位位于HPV16L1的高可变环区，这一区域在装配 成VLP时朝向颗粒的外表面；在HPV16L1的第266位和第267位氨基酸之间插入 一个外源肽，不会影响HPV16L1自身装配成VLP的能力，还能使机体产生的中 和抗体滴度明显下降。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于Vasohibin基因的伪病毒， 可以最大限度地逃避机体清除机制，专一性地被肿瘤新生血管内皮细胞及肿瘤 细胞摄取，发挥同时抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，大大提高 肿瘤治疗的有效性和安全性。