[发明专利]体外检测精子-卵母细胞相互作用的方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外检测精子-卵母细胞相互作用的方法，更具体地，涉及体外联合检测精子-卵母细胞相互作用的方法。

背景技术

哺乳动物的精子必须具备良好的生理功能才能完成受精过程。受精是一个复杂的过程，需要经历精子与卵细胞透明带结合、透明带诱发顶体反应和精子穿过透明带并与卵黄膜结合等过程才能完成，任何一个环节出现问题均可导致受精失败。可通过精子-卵母细胞相互作用试验对这些过程进行体外评估，从而寻找不孕不育的病因，并为辅助生殖助孕方式的选择提供直接的科学依据。

精子-卵母细胞相互作用试验包括精子-透明带结合试验、透明带诱发精子顶体反应试验和精子-透明带穿透试验，通常需要分成三个不同检测项目分别进行检测，需要消耗较多标本资源，检测成本高，检测时间长且检测效率低。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于减少标本资源的消耗，降低检测成本，降低检测时间并提高检测效率。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种体外检测精子-卵母细胞相互作用的方法，所述方法包括如下步骤：a.上泳法或密度梯度法提取精子；b.在培养液中按一定比例混合经步骤a提取后的精子与卵母细胞，另设立卵母细胞空白对照，并均置于培养箱中反应；c.去除步骤b中未与卵母细胞表面结合的精子，倒置相差显微镜下检测与卵母细胞透明带结合的精子数量；d.使步骤c中与卵母细胞透明带结合的精子和卵母细胞分离，分别收集分离后的精子和卵母细胞；e.将卵母细胞空白对照精子、经步骤d分离后的精子涂于载玻片上，干燥，固定液固定，洗涤，加入荧光素-凝集素标记物，反应后再次洗涤，荧光显微镜下检测精子顶体反应率；f.倒置相差显微镜下检测经步骤d分离的卵母细胞胞内已穿透进入其中的精子数量。

其中所述步骤c中通过以下方法去除步骤b中未与卵母细胞表面结合的精子：将反应后的卵母细胞转移至另一盛有培养液的细胞培养皿中，反复吹打卵母细胞，然后转移精子-卵母细胞结合物至另一盛有培养液的细胞培养皿中。

其中所述步骤d中通过以下方法使步骤c中与卵母细胞透明带结合的精子和卵母细胞分离：将精子-卵母细胞结合物移入微滴中，反复吹打卵母细胞，然后将卵母细胞转移至另一盛有培养液的细胞培养皿中。

其中所述培养液的NaCl重量含量为0.28-1.11％、KCl重量含量为0.02-0.07％、CaCl₂·2H₂O重量含量为0.01-0.05％、KH₂PO₄重量含量为0.01-0.03％、MgSO4·7H₂O重量含量为0.01-0.06％、酚红重量含量为0.0005-0.003‰、NaHCO₃重量含量为0.10-0.42％、葡萄糖重量含量为0.05-0.20％、焦丙酮酸钠重量含量为0.015-0.060‰、BSA重量含量为0.17-0.70％、青霉素的含量为10000-20000单位％、硫酸链霉素重量含量为0.05-0.50‰和乳酸钠糖浆(600g/L)体积含量为0.18-0.74％，余量为蒸馏水。

其中所述步骤b中的卵母细胞可以是新鲜卵母细胞或者是保存在卵细胞保存液中的卵母细胞，其中所述卵细胞保存液的(NH₄)₂SO₄重量含量为6.6-26.4％和Tris重量含量为0.12-0.48％，余量为蒸馏水，其pH值为7.0-7.8。

其中可在步骤e中荧光显微镜下计数精子顶体反应率之前加入荧光封固液，所述荧光封固液是含对苯二胺的磷酸盐缓冲液，其pH值为7.5-9.0。

其中所述步骤e中固定液是多聚甲醛、丙酮和甲醇的混合液。

其中所述步骤e中洗涤所使用的洗涤液是含Tween-20的磷酸盐缓冲液，其pH值为7.2-7.6。

其中所述步骤e中荧光素-凝集素标记物中的荧光素为异硫氰酸荧光素(FITC)或四甲基异硫氰酸若丹明(TRITC)，凝集素为刀豆蛋白A、豌豆凝集素或花生凝集素。

本发明的有益效果在于实现了精子-透明带结合试验、透明带诱发精子顶体反应和精子-透明带穿透试验三个项目的联合检测，并由此减少了精子标本的消耗，尤其是减少了来源困难的卵母细胞的消耗，较大程度地节约了标本资源；减少了操作环节，较大程度地降低了检测成本；减少了操作步骤，降低了操作时间，大大提高了检测效率；同时所述检测方法具有较高的准确性，有利于临床常规应用与推广。

具体实施方式