[发明专利]一种呋喃妥因残留酶联免疫检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于酶联免疫检测技术领域，尤其是涉及一种呋喃妥因残留酶联免疫检测试剂盒。

背景技术

硝基呋喃是人工合成的广谱抗生素，由于价格低、效果好，曾广泛用于水产、兽禽的消毒杀菌。上世纪90年代发现硝基呋喃及其代谢物有致癌、致畸作用，世界各国开始禁止硝基呋喃的使用。目前，世界各国食品监督机构所采用的标准是硝基呋喃类代谢产物不得检出，检测低限为1ppb。

硝基呋喃进入体内后迅速代谢，难以检测，但形成的代谢物与蛋白质结合稳定，可以保存数周。目前国际上通行的方法是检测动物组织中的硝基呋喃代谢物残留。

鉴于代谢物的分子量较小，先需用邻硝基苯甲醛等跟代谢物反应，然后用LC-UV、LC-MS、LC-MS/MS等检测它们的产物。尽管高效液相色谱、串联质谱联用具有灵敏度高、可以定性定量鉴定等优点；但是高效液相色谱、串联质谱联用需要贵重仪器设备，检测成本高。不适合现场检测和推广，以及大量样本的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、快速、灵敏、不需要贵重仪器、高通量的优点，很适合快速筛选的呋喃妥因残留酶联免疫检测试剂盒，解决现有技术存在的缺陷。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种呋喃妥因残留酶联免疫检测试剂盒，包括：

a)酶标板，所述的酶标板包被有呋喃妥因代谢物AHD或者呋喃妥因代谢物衍生物跟蛋白质的偶联抗原；所述固定包被抗原的载体为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、琼脂糖凝胶、硅橡胶或者玻璃，该载体的形式为微量反应板凹孔、小珠、小圆片或者试管；所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、或者血兰蛋白(KLH)；所述呋喃妥因代谢物或者呋喃妥因代谢物衍生物与载体蛋白的偶联物通过混合酸酐法或活化酶法偶联得到；

b)标准溶液，所述标准品为邻硝基苯甲醛先溶于二甲亚砜，再跟海特因衍生物反应制得；其浓度分别为：0，0.1，0.3，0.9，2.7，8.1ppb；

c)抗体工作液；

d)洗涤液；

e)酶标记物；

f)底物显色液；

g)终止液。

优选的方案是：所述酶标记物为酶标记的二抗、酶标记呋喃妥因代谢物特异性抗体或酶标记呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体、酶标记呋喃妥因代谢物抗原或酶标记呋喃妥因代谢物衍生物抗原；所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，可通过戊二醛法或者过碘酸盐法交联在二抗上；所述二抗为羊抗兔二抗或者羊抗鼠二抗。

更为优选的方案是：所述呋喃妥因代谢物特异性抗体为呋喃妥因代谢物单克隆抗体或呋喃妥因代谢物多克隆抗体，呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体为呋喃妥因代谢物衍生物单克隆抗体或呋喃妥因代谢物衍生物多克隆抗体；所述多克隆抗体或者单克隆抗体为为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体。

更为优选的方案是：所述的单克隆抗体鼠源单克隆抗体。

更为优选的方案是：所述标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液为底物显色液A和底物显色液B，其中底物显色液A为氧化氢或过氧化脲，底物显色液B邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)；所述标记酶为碱性磷酸酶时，显示液为对硝基苯磷酸酯缓冲液，终止液为2MNaOH溶液。

更为优选的方案是：免疫小鼠所用佐剂为福氏佐剂。

更为优选的方案是：洗涤液的配方为：0.05％Tween-20，10mM磷酸缓冲液，0.15M NaCl，pH7.4。

更为优选的方案是：封闭液中含有3％的脱脂奶粉。

跟为优选的方案：终止液的配方为2M H₂SO₄。

本发明提供的检测水产等动物源食品中呋喃妥因残留检测试剂盒，先用间羧基苯甲醛跟海特因结合，间羧基苯甲醛跟海特因在吡啶中结合，制得分子结构类似物，然后利用其上的羧基跟载体牛血清白蛋白的氨基结合，把海特因联接到蛋白质上，通过免疫和细胞融合制备了高亲和力和特异性的单克隆抗体。本发明采用间羧基苯甲醛和海特因的衍生物跟卵清蛋白的偶联物作为包被抗原，通过包被蛋白浓度、抗体浓度、酶标二抗浓度、反应缓冲液的优化，制备灵敏、稳定的ELISA试剂盒。

本发明的一个具体方案包括：

制备单克隆抗体

1)免疫原的制备间羧基苯甲醛与海特因盐酸盐反应制备出间羧基苯甲醛跟海特因衍生物。将该衍生物与牛血清白蛋白偶联在一起制成免疫原。