[发明专利]大豆检疫性真菌病害多重实时荧光PCR检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时检测大豆疫病菌、大豆拟茎点霉种子腐烂病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌四种中一种或多种大豆真菌病害的简单、快速、特异、灵敏的实时荧光PCR检测方法及其试剂盒。适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

背景技术

大豆(Glycine max)是我国重要的油料作物和粮食作物，也是世界上食用油和植物蛋白的主要来源，在我国国民经济中占有重要地位。目前我国大豆产量居世界第四位，但仍然不能满足国内植物油及饲料蛋白加工的需要。随着我国进口大豆的数量逐年递增，各种危害大豆生产的病害传入的风险也逐渐增大。其中本发明涉及的四种大豆真菌病害是目前严重影响大豆生产及贸易的真菌病害，具有重要的检疫重要性和经济重要性。

大豆疫病菌(Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann，简称PS)是大豆生产上的毁灭性病害之一，主要引起大豆疫霉根腐病(SoybeanPhytophthora Root Rot)。该病害在加拿大、阿根廷、巴西、澳大利亚、日本、中国等20多个国家均有发病报道，造成严重的经济损失。1989-1991年间在美国大豆主产区的28个州，由该病害造成的年平均损失就达1.88亿美元。目前全世界每年因大豆疫霉根腐病造成的损失达10多亿美元。大豆疫霉菌在大豆的各个生长发育期均可侵染和危害，引起寄主根、茎、枝和种子腐烂，严重时造成绝产，是危害极其严重的土传病害。由于疫霉菌的形态特征和生物学特性具有较大的变异，采用传统的方法，难以区分形态和习性相似的种，而传统的检测方法检测时间长、工作量大，无法满足快速检疫的需要。近年来国内外对该病的快速检测方法主要集中在常规PCR和实时荧光PCR方法。

大豆拟茎点霉种子腐烂病菌(Phomopsis longicolla，简称PL)造成种子皱缩、变长、皮裂，并出现白垩。感病的种子经常不能萌发或者萌发延迟。种子感病导致出苗前后的猝死，在恶劣条件下，严重影响大豆的产量和品质。感病的作物残体和土壤是初侵染的主要侵染源。带病植株也是该病原长距离传播的一个重要因素。大豆豆荚在其形成后的任何时间都可能被侵染，给大豆的生产带来严重的影响。PL的寄主范围很广，除大豆外，还危害三叶草、绿豆、利马豆、豌豆、花生、大蒜、洋葱、辣椒、番茄、三裂叶豚草、苍耳、小地锦草、皱叶酸模等。DPC、DPM、DPS、PL共同引起间座壳-拟茎点综合症，产生的危害超过其中任何单一真菌病害，而PL是其中最常被分离到和最为重要的一种。目前主要有PCR-RFLP等方法检测。

大豆茎溃疡病(Soybean Stem Canker，简称SSC)是大豆生产上的一种重要病害，病原菌分别为大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum(Cookeet Ell)Sacc.var.caulivora Athow et Caldwell，简称DPC)和大豆南方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum(Cooke et Ell.)Sacc.var.meridionalis F.A.Fernandez，简称DPM)，这两种病原菌都是我国重点关注进境植物检疫对象。该病菌侵染植株后迅速发展形成茎杆环状损伤，并可导致正在生长的植株死亡。发病严重的田块有80％的植株受到侵染，产量损失高达50％，造成严重的经济损失。近年来该病害发展迅速，在美国、阿根廷、巴西、加拿大、巴拉圭、意大利、前南斯拉夫、克罗地亚等欧洲部分国家及地区有发生报道，是国外大豆生产上的重要病害。目前我国尚没有DPM的发生报道。

总的来说，目前对于四种真菌病害的检测方法存在诸多不足。比如形态学检测周期长、需要丰富经验，有的真菌采用形态学鉴定还存在较大的争议或难以区分其近似形态的种属；而现有的分子检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好等。并且，目前尚未有能对四种检疫性大豆真菌病害同时进行检测的多重检测方法。

随着我国对进口大豆需求的增加，各种大豆病害传入的风险也不断增加，对我国的大豆生产构成巨大的潜在威胁。因此，在口岸检疫部门采用简单、快速、特异、灵敏的检测方法对其中具有严重影响的病害进行检测，对保护我国大豆生产，防止其重要检疫性病原真菌的传入具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提出快速、可靠、灵敏度高、特异性强和价格便宜的检测大豆疫病菌、大豆拟茎点霉种子腐烂病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌四种大豆大豆真菌病害重要病害的引物、寡核苷酸探针、试剂盒及多重实时荧光PCR检测方法。