[发明专利]一种用于检测猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒及其混合感染的试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒及其混合感染的试剂盒和方法，更具体地，涉及四重PCR法检测猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒及其混合感染的试剂盒和方法。

背景技术

猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。猪细小病毒感染的主要特征是孕猪尤其是初产母猪及血清学阴性经产母猪在怀孕前期容易受到感染，引起胚胎或胎儿的感染和死亡，导致母猪发生流产、死胎、胎儿木乃伊化及新生仔猪的死亡。有研究证实PPV与猪的多系统衰竭综合征和猪的非化脓性心肌炎有关，同时还可引起仔猪腹泻和发生皮炎。

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)为圆环病毒科圆环病毒属成员，是迄今已知最小的动物病毒之一。根据其抗原性及基因组成不同，PCV可分为2种血清型，即PCV1及PCV2。动物实验表明PCV1无致病性，广泛存在于正常猪体内各组织器官中。PCV2具有致病性，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)，虽然认为PMWS是一种多因子疾病，但大多数研究者认为PCV2是源发性病因，因此PCV2近年来引起了人们广泛关注。PCV2主要侵犯机体免疫系统，临床上常呈并发或继发感染，使病情加重，以至死亡，从而造成严重经济损失。同时，猪呼吸与繁殖障碍综合征、猪细小病毒(PPV)和传染性先天性震颤等也都与PCV-2感染有密切关系。

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的一种或多种动物感染的急性传染病。PRV感染猪后，仔猪表现出严重的中枢神经症状，并导致高死亡率，成年猪则长期潜伏，并可导致妊娠母猪流产和死亡。猪感染PRV后，免疫系统受到损害，因而更易继发其它疾病，如猪瘟或猪繁殖与呼吸综合征等。猪PR在我国流行范围很广，迄今已有20多个省份发生该病。自上世纪70年代以来，人工筛选的自然弱毒疫苗及基因工程缺失疫苗的广泛应用对防治伪狂犬病做出了重要贡献。美国研制出的世界上第一个伪狂犬病病毒基因工程缺失疫苗(OMNIVAC-PRV)在1986年获得了美国政府颁发的生产许可证，该疫苗缺失了gE基因。我国使用Bartha-k61株弱毒疫苗，其基因中整个gE和大部分gI序列的缺失。90年代以后，欧美等国家则只允许gE基因缺失的疫苗上市。这些弱毒疫苗和基因工程疫苗可使猪免于发病，但不能阻止野毒潜伏感染，潜伏感染的野毒在一定条件下又会传染给其它猪进而使其发病。

由于上述几种疾病在临床上表现出相似的症状，因此常规诊断方法很难将这些症状相似的一类疾病加以区分，而混合感染多种病原时，则更难以进行早期快速检测。同时，常规的病原学和血清学检测方法又存在着操作繁杂、费时费力和敏感性低等不足。因此，建立准确快速的诊断方法对这些疾病的防治具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于实现对猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)及其混合感染的早期快速检测。

为解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括10×PCR buffer、dNTP、DMSO、Taq酶、阳性对照试样以及选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列的引物混合物、SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：8序列的5’端和/或3’端延长序列的引物混合物、与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列同源性大于85％的序列的引物混合物或者与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列碱基互补的序列的引物混合物中任一种的引物。

其中所述10×PCR buffer包含500mmol/L KCl、100mmol/LTris-Cl和15mmol/L MgCl₂，所述dNTP包含浓度各为25mmol/L的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，所述Taq酶的浓度为5u/μL。

其中所述阳性对照试样包含23.5μg/mL PPV、25μg/mL PCV2和20μg/mL PRV。

其中所述引物为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列的引物混合物，各引物的浓度分别为10μM。

本发明另一方面提供了一种检测方法，所述方法包括以下步骤：