[发明专利]白细胞分类计数试剂、试剂盒及其制备方法和白细胞分类计数的方法

说明书

技术领域

本发明涉及血液细胞分类计数试剂及血液细胞分类计数方法，更具体地讲，本发明涉及用于对白细胞进行分类计数的血液分析试剂、包含所述试剂的试剂盒及其制备方法，以及采用所述试剂或试剂盒进行白细胞分类计数的方法。

背景技术

血液细胞大致分为三类：红细胞、白细胞和血小板，其中白细胞又由淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞五个亚类组成。在生物学分析领域，尤其是临床检验分析领域，针对不同亚类白细胞进行准确的分类对于诊断和研究有着非常重要的作用，而各个亚类白细胞含量的变化在临床上被用作诊断和治疗的重要指标。例如，急性细菌性感染会造成中性粒细胞增多，寄生虫感染和过敏性疾病等会造成嗜酸性粒细胞增多。

迄今为止，有关对白细胞进行分类和计数的试剂和方法已经有很多报道。其基本方法是采用溶血剂将红细胞和血小板溶解后对白细胞进行分类计数。而其中大部分是采用季铵盐或吡啶鎓等阳离子表面活性剂溶解红细胞，达到白细胞分类的目的。但相比阴离子和非离子型表面活性剂，季铵盐等阳离子型表面活性剂毒性较高。且其本身具有较强的抑菌作用，释放到环境中，会破坏环境中的微生物，对环境造成一定影响。

除了阳离子型表面活性剂以外，糖苷类化合物中的一种，皂苷类非离子表面活性剂作为一种来源广泛的纯天然表面活性剂，由于其具有较强的溶血作用，在白细胞分类中也有应用。

美国专利5155044公开了一种采用两步法进行白细胞分类的方法。该方法包含一种对全血样本进行化学处理的试剂系统，该系统包括一种溶血剂和一种抑制剂。该溶血剂含酸或酸和皂苷的混合物。在该方法中，酸起到决定性作用，皂苷只起到更加彻底破坏红细胞，以避免其干扰测定的作用。

美国专利4751179公开了一种白细胞分类的试剂系统和用自动细胞计数装置区分白细胞的方法。该试剂系统由包含皂苷的第一试剂和用于固定的第二试剂组成。

美国专利5840515公开了一种对血液样本中白细胞进行分类的方法。该方法包括三个步骤：第一步，使用包含皂苷的溶解剂对红细胞进行裂解，同时不破坏白细胞的完整性；第二步，对红细胞裂解的终点进行判断；第三步，反应达到终点阈值后，加入抑制剂，终止溶解试剂的溶血作用。

美国专利6632676公开了一种对白细胞进行五分类的方法。该方法采用两种试剂：试剂一为一种含皂苷的溶血剂；试剂二为一种抑制剂，具有调节作用的缓冲体系，以终止皂苷的溶血作用。

美国专利6114130公开了一种用于白细胞四分类的试剂。该试剂包含一种阳离子表面活性剂、一种糖苷类物质(特指皂苷)、至少一种无机盐和调节pH值的缓冲体系。

上面所提到的使用皂苷类非离子型表面活性剂对白细胞进行分类的现有技术中，大部分使用两步法或三步法，需要两种或多种试剂，增加了仪器设计的复杂度及生产成本。此外，目前使用皂苷对白细胞的各种分类方法，所获得的分类效果并不理想，尤其是淋巴细胞与单核细胞两个细胞群之间的分类不清晰。

发明内容

本发明一方面涉及一种白细胞分类计数试剂，所述试剂包括：

(1)花菁类荧光染料；

(2)糖苷类化合物。

优选所述糖苷类化合物为皂苷或烷基糖苷类化合物。

优选所述花菁类荧光染料为通式(I)或(II)的化合物或其组合：

其中

n为1、2或3；

X为C(CH₃)₂、O、S或Se；

R₁和R₂各自独立选自H、C_1-18烷基、-C_1-6烷基-OR₅或卤素；

R₃为H、C_1-18烷基、OR₅、-C_1-6烷基-OR₅、COOR₅、NO₂、CN或卤素；

R₄为C_1-18烷基、-C_1-6烷基-OR₅、苄基或卤素，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；

R₅为H或C_1-18烷基；

Y^-为负离子；

其中

m为1、2或3；