[发明专利]一种同步化调控针叶树体细胞胚发生方法及其培养基

权利要求书

1.一种同步化调控针叶树体细胞胚发生方法，包括以下步骤：

A、将针叶树种未成熟胚消毒后接种于诱导培养基中，在23±5℃温度、 暗培养条件下进行培养，得到胚性细胞系；

B、将胚性细胞在诱导培养基中继代培养两次后，选取新分化的胚性细 胞，转接于继代培养基中，控制摇床转速为110±30转/分钟，在23±5℃ 温度、暗培养条件下进行胚性保持继代培养；

C、将继代后的胚性细胞系接种于增殖培养基中，控制摇床转速为110 ±30转/分钟，在23±5℃温度、暗培养条件下，进行同步化调控培养，增 殖获得同步化的胚性细胞系；

D、将步骤C中得到的胚性细胞系培养物接种于增殖培养基中，在23 ±5℃温度、暗培养条件下，进行胚性细胞系原胚的规模化增殖培养；

E、胚性细胞在增殖培养基中增殖培养到预定数量后，转接于成熟培养 基中进行成熟培养，在23±5℃温度、暗培养条件下进行培养，得到体细胞 胚；

所述步骤A中采用的诱导培养基中，每升溶液包括以下组分：

KNO₃              2273mg，

NH₄NO₃            267mg，

KH₂PO₄            82mg，

CaCl₂.2H₂O        326mg，

MgSO₄.7H₂O        160mg，

H₃BO₃             3.1mg，

ZnSO₄.7H₂O        4.3mg，

MnSO₄.H₂O         8.4mg，

Na₂MoO₄.2H₂O      0.12mg，

KI                0.42mg，

CuSO₄.5H₂O        0.0125mg，

CoCl₂             0.0125mg，

FeSO₄.7H₂O        14.12mg，

乙二胺四乙酸二钠  19.23mg，

肌醇                1,000mg，

维生素B₁            0.5mg，

谷氨酰胺            450mg，

蔗糖                30,000mg，

2，4-二氯苯氧乙酸   1.1mg，

酸水解酪蛋白        500mg，

6-苄氨基嘌呤        0.4mg，

激动素              0.4mg，

琼脂                3,000mg；

所述步骤B中采用的继代培养基中，每升溶液包括以下组分：

KNO₃                2718mg，

NH₄NO₃              328mg，

KH₂PO₄              112mg，

CaCl₂.2H₂O          326mg，

MgSO₄.7H₂O          201mg，

H₃BO₃               8.9mg，

ZnSO₄.7H₂O          4.8mg，

MnSO₄.H₂O           10.5mg，

Na₂MoO₄.2H₂O        0.14mg，

KI                  0.48mg，

CuSO₄.5H₂O          0.0125mg，

CoCl₂               0.0125mg，

FeSO₄.7H₂O          13.12mg，

乙二胺四乙酸二钠    17.42mg，

肌醇                1,000mg，

维生素B₁            0.5mg，

谷氨酰胺            450mg，

甘露醇              2,000mg，

蔗糖                30,000mg，

2，4-二氯苯氧乙酸   0.7mg，

酸水解酪蛋白        500mg，

6-苄氨基嘌呤        0.1mg；

所述步骤C或D中采用的增殖培养基中，每升溶液包括以下组分：

KNO₃                2336mg，

NH₄NO₃              276mg，

KH₂PO₄              86mg，

CaCl₂.2H₂O          326mg，

MgSO₄.7H₂O        172mg，

H₃BO₃             3.1mg，

ZnSO₄.7H₂O        4.3mg，

MnSO₄.H₂O         8.45mg，

Na₂MoO₄.2H₂O      0.125mg，

KI                0.42mg，

CuSO₄.5H₂O        0.0125mg，

CoCl₂             0.0125mg，

FeSO₄.7H₂O        16.13mg，

乙二胺四乙酸二钠  21.64mg，

肌醇              1,000mg，

维生素B₁          0.5mg，

谷氨酰胺          450mg，

甘露醇            3,000mg，

蔗糖              30,000mg，

2，4-二氯苯氧乙酸 0.5mg，

酸水解酪蛋白      500mg，

6-苄氨基嘌呤      0.3mg；

所述步骤E中采用的成熟培养基中，每升溶液包括以下组分：

KNO₃              2542mg，

NH₄NO₃            285mg，

KH₂PO₄            88mg，

CaCl₂.2H₂O        326mg，

MgSO₄.7H₂O        188mg，

H₃BO₃             8.9mg，

ZnSO₄.7H₂O        4.52mg，

MnSO₄.H₂O         8.89mg，

Na₂MoO₄.2H₂O      0.131mg，

KI                0.46mg，

CuSO₄.5H₂O        0.0125mg，

CoCl₂             0.0125mg，

FeSO₄.7H₂O        14.33mg，

乙二胺四乙酸二钠  18.22mg，

肌醇              1,000mg，

维生素B₁          0.5mg，

谷氨酰胺          450mg，

甘露醇            3,000mg，

蔗糖              30,000mg，

聚乙二醇        80,000mg，

酸水解酪蛋白    500mg，

脱落酸          30mg，

琼脂            3,000mg。