[发明专利]人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体及其制备方法及应用

权利要求书

1.人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)表达和纯化K5多肽，其具体方法如下：将含有K5部分序列的cDNA的质粒 pPIC9K-K5，经测序鉴定正确后，利用限制性内切酶Sal I线性化，通过电转化至毕赤酵母 GS115中，通过PCR方法鉴定阳性重组子，挑取的阳性重组子经甲醇诱导表达挑选高拷贝阳 性菌，进行诱导表达，收集部分酵母上清，经三氯乙酸沉淀法浓缩蛋白后，Tricine SDS-PAGE 电泳检测，用硫酸铵盐沉淀法纯化浓缩蛋白、透析后，阴离子交换层析过柱，用洗脱液上柱， 流出液即为纯化的K5蛋白；

2)制备人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体，其具体方法如下：用纯化的15kDa的 K5蛋白与弗氏佐剂混合，免疫动物，经纯化获得人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体；

所述用纯化的15kDa的K5蛋白与弗氏佐剂混合，免疫动物，经纯化的具体方法如下： 第一次用纯化的K5蛋白1mg加弗氏完全佐剂，剧烈震荡，充分乳化后免疫新西兰兔，每隔 14天用纯化的K5蛋白0.5mg加不完全弗氏佐剂，与生理盐水乳化，加强免疫两次，用颈动 脉取血法接取兔血清，用ELISA法检测多克隆抗体的效价，抗体效价分析表明抗体效价达到 1∶1000，将血清总蛋白经过50％硫酸胺沉淀后，结合于protein A柱上，用亲和层析法分离 出多克隆抗体。

2.如权利要求1所述的人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述进 行诱导表达时，培养条件为28～30℃，250rpm，48h，按体积百分比，每24h补加甲醇至1％。

3.如权利要求1所述的人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述用 硫酸铵盐沉淀法纯化浓缩蛋白的硫酸铵盐的浓度按质量百分比为65％。

4.如权利要求1所述的人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述洗 脱液用含0.2mol/L NaCl的洗脱液。