[发明专利]一株产碱性纤维素酶菌株LT3及其选育方法和产酶条件初步优化

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体涉及一株产碱性纤维素酶菌株LT3及其选育方法和产酶条件初步优化。

背景技术

纤维素材料是自然界中最丰富的可再生资源。利用现代生物技术将纤维素材料转化为乙醇等液体燃料，不仅可以作为新资源新能源为人类造福，缓解或解决化石能源对环境污染的问题，同时也可以实现对农业剩余资源的高效利用，现已受到世界各国的普遍重视。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法，纤维素酶能将天然纤维素降解，生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖，然而目前主要制约纤维素材料转化乙醇产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下，造成生产成本过高。因此，筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。目前研究较多的是霉菌，其中木霉、曲霉、根霉和青霉均具有较强的酶活力，尤以绿色木霉、里氏木霉和康氏木霉为典型。而对细菌的研究很少有报道。由细菌所产生的纤维素酶一般最适pH为中性至偏碱性，近20年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一株产碱性纤维素酶菌株LT3及其选育方法和产酶条件初步优化，对研究纤维素酶作用机理及纤维素酶制剂的生产具有潜在理论和应用价值；该纤维素酶菌株LT3能产生单一组份的纤维素酶，便于分离纯化，是纤维素酶基因克隆的理想材料，对于构建纤维素分解工程菌株以及探索纤维素酶作用机制有着潜在的理论和实践意义，方法简单快速，易于实施。

本发明的产碱性纤维素酶菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LT3：所述产碱性纤维素酶菌株LT3的16s rDNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

本发明的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LT3，已经于2009年1月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2879。

本发明的菌株LT3形态学鉴定：使用革兰氏染色法对LT3进行染色，结果表明：该菌株为革兰氏阳性细菌，菌体呈杆状，有芽孢，呈椭圆形，位于中央或近中央。周生鞭毛。其繁殖体不耐热，120℃灭菌20分钟可被杀死。该菌株适宜pH发酵条件为7.0-8.5，与其他蜡状芽孢杆菌相比，该菌株具有产碱性纤维素酶特征。

本发明的通过对从腐烂朽木及其附近土壤中得到的样品进行富集培养、分离纯化得到16株纤维素分解菌，经刚果红染色鉴定和液体发酵获得一株纤维素酶分泌量较高的细菌LT3，并对其进行菌种初步鉴定，再通过克隆其16s rDNA序列，对其进行系统进化分析，鉴定为蜡状芽孢杆菌。

本发明的显著优点：本发明蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LT3分离自朽木的特殊环境中，具有较宽的适应pH范围，能产生胞外纤维素酶，并且所产的纤维素酶具有耐受碱性环境的特性。除了便于分离纯化之外，该菌还是纤维素酶基因克隆的理想材料，对于构建纤维素分解工程菌株以及探索纤维素酶作用机制有着潜在的理论和实践意义。

本发明通过刚果红鉴定板来鉴定产纤维素酶菌是一种快速简便的筛选方法，透明圈直径和鉴定板孔径大小的比值能够直接的反映该菌产纤维素酶的能力，其原理是刚果红是一种能够和大分子多糖相结合的染色剂，染色之后能和纤维素结合形成红色，产纤维素酶菌在CMC平板上培养后产生的纤维素酶将纤维素水解成小分子的还原糖，在用刚果红染色之后没有被水解的纤维素能够和刚果红结合显红色，而水解的部位则不能和刚果红结合而出现透明圈。

本发明应用16S rDNA序列分析的分子生物学技术，总DNA提取、PCR扩增、16S rDNA测序及序列分析并结合形态学观察初步鉴定该降解纤维素菌，能够快速准确的对微生物种属进行鉴定。

附图说明

图1是使用革兰氏染色法对本发明的菌株LT3进行染色后菌株显微图。

图2是本发明部分芽孢杆菌以16S rDNA同源性为基础的系统进化树。

图3为本发明菌株LT3PH优化水解圈大小图。

图4为本发明菌株LT3基因组DNA。

图5是本发明菌株LT3PCR扩增产物。

具体实施方式

以下是本发明的具体选育方法，并结合实施例充分说明本发明。

选育实施例：1材料与方法

1.1材料

主要试剂：