[发明专利]多重荧光 P C R同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物、探针、试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物、探针、试剂盒及其检测方法。

背景技术

白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是对虾白斑综合征(white spot syndrome，WSS)的致病原，WSS是全球对虾养殖业危害性最大的病害之一，是国际兽医局(OIE)规定需要报告的重要水生动物疾病，在我国农业部2008年新发布的动物传染病名录中被列为一类传染病。自20世纪90年代初首先在我国台湾地区发生以来，至今已在世界各国的对虾养殖地区流行，造成巨大的经济损失。WSSV宿主十分广泛，由该病毒引起的病害传播迅速，可导致斑节对虾(Penaeus monodon)、日本对虾(P.japonicus)、中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)、印度对虾(P.indicus)、南美白对虾(P.vannamei)、褐对虾(P.aztecus)、桃红对虾(P.duorarum)等对虾感染发病大规模死亡。对虾传染性皮下及造血器官坏死病(Infections Hypodermal and Haematopoietic Nerosis Viurs IHHNV)也是世界各地养殖对虾常见的传染病之一，被国际兽医局(OIE)列为重要的甲壳动物传染病。该病首先在夏威夷红额角对虾(P.stylirostris)仔虾体内发现，后来发现该病毒在亚洲和太平洋地区广泛存在。IHHNV主要危害红额角对虾，发病后死亡率可高达90％，对稚虾和幼虾危害最严重。对南美白对虾、斑节对虾和日本对虾也有较大危害，可导致慢性矮小残缺综合症。该病毒还可感染短沟对虾(P.semisulcatus)、印度对虾、中国对虾和加州对虾(P.californiensis)。我国是养虾大国，对虾养殖是我国许多沿海省市的支柱产业，建立快速、准确的WSSV和IHHNV检测方法，可以为口岸动物检疫提供检测依据，有效地控制这些病害的传播，应用到生产实践中，可以为预防这些传染病提供诊断依据。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物、探针、试剂盒及其检测方法。本发明具有特异性好，检测方法快速简便，准确性高，灵敏度高的特点。

为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案：

一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物，由检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)的正向引物FP1和反向引物RP1以及检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的正向引物FP2和反向引物RP2组成；其中检测对虾白斑综合征病毒的引物的正向引物FP1的序列SEQ ID NO.1和反向引物RP1的序列SEQ ID NO.2如下：

SEQ ID NO.1：5′-TGGAATGTCATCGCCAGCAC-3′；

SEQ ID NO.2：5′-CAGTTCAGATTCGTTACCGTTTCC-3′；

检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物的正向引物FP2的序列SEQ ID NO.4和反向引物RP2的序列SEQ ID NO.5如下：

SEQ ID NO.4：5’-GACATAGAGCTACAATCCTCGCCTAT-3’；

SEQ ID NO.5：5’-CAAGTACCGTAGTCGCTTCAGCTT-3’。

一种多重荧光PCR同时检测对虾白斑综合征病毒及对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的探针，由检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)的探针LP1和检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的探针LP2组成；其中检测对虾白斑综合征病毒的引物配合使用的探针LP1的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：5′-CACCGCCGACGCCAAGGGAACTG-3′；

检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的引物配合使用的探针LP2的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.6：5′-TGGGAGTTACCTTTGCTGCCAGAGCC-3′。