[发明专利]用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因突变检测，特别涉及检测人类表皮生长因子受体EGFR基因29种缺失突变的引物、探针及方法。

背景技术

人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)存在于所有正常上皮和部分间叶来源的细胞，对细胞的生长、分化的调节有重要作用。EGFR可以激活酪氨酸激酶，从而打开下游信号通路。因此，EGFR成为肿瘤尤其是非小细胞肺癌靶向治疗研究的一个重要靶点。目前，临床上EGFR靶向治疗主要包括小分子酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体两个部分，如阿斯利康公司的吉非替尼(易瑞沙)，罗氏公司的恶罗替尼(特罗凯)。

近年来大量研究发现一些肺癌病人EGFR基因的编码区，主要是在外显子18-21上会发生突变，而这些突变与吉非替尼和恶罗替尼等药物的临床疗效有关，即与药物反应性有关，原因可能是因为这些突变改变了EGFR胞内ATP结合区的结构，提高了EGFR对吉非替尼的结合能力。目前，虽然已经发现不下30种突变，不过主要是外显子19上的缺失突变和外显子21上L858R的点突变；外显子19上747-750位氨基酸的大约有20多种不同缺失约占突变的45％，其中以2235_2249del15和2236_2250del15最为常见；外显子21上858位氨基酸的替代约占突变的40-45％；外显子18点突变(G719S或G719C)约占突变的5％；外显子20上的插入突变约占突变的1％左右。外显子18的G719X突变约占突变的5％左右。但是，在肺癌患者中EGFR的突变率并不高，美国肺癌病人中EGFR基因的突变率仅有2％，日本为40％。中国女性非小细胞肺癌的病人中EGFR基因的突变率为30％，如果这部分患者均能应用吉非替尼或恶罗替尼治疗将会明显改善预后。

这些靶向药物虽然对某些人群疗效非常，但是价格昂贵，如果病人不携带有EGFR突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查检测病人是否携带有EGFR基因突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。所以，如何快速准确地检测这些与药物反应性有关的EGFR基因突变成为人们亟待解决的问题。

建立对肿瘤病人EGFR基因突变检测方法不同于检测一般性的遗传突变，一般的遗传性突变即便是杂合性突变(异质性)和野生比例永远是1/1，靠一般的探针技术就可以对突变和野生进行很好的区分。然而，这些EGFR突变都是体细胞突变，提取模板中存在大量野生型DNA，突变所占比例不确定，直接来自手术切除的样品，突变比例高，可能达到20％以上，或许突变含量只有0.1％。虽然可以通过显微激光捕获样品中的肿瘤细胞，提高样品中肿瘤细胞的比率。不过即便是肿瘤细胞，也不是100％的肿瘤细胞都带有此类突变，处于不同肿瘤组织部位的细胞或许不太一样。如果是来自血液的样品突变含量或许会更低。这就是稀有突变检测的难点：一面要具有高灵敏的检测能力——个位数甚至单个突变拷贝，另外必须保证极高的特异性——面对上千倍上万倍的野生型模板的干扰，不出现假阳性。

目前检测EGFR基因稀有突变的方法有多种，检测能力在1％～20％。主要有两大类，一类是非实时PCR，主要有测序和DHPLC，检测能力仅为20％和5％，而且需要PCR后处理，步骤繁琐，耗时长，容易污染；另一类是实时PCR，虽然都是基于实时PCR的技术平台，但是为了提高检测方法的选择能力，不同学者所用策略不尽相同。主要有完全依赖DNA序列自身识别特异性和依赖酶识别特异性两大类策略，有TaqMan探针、高分辨熔解曲线分析、竞争性抑制实时PCR方法，检测能力5％～20％之间，DxS蝎子引物法检测能力可达1％。

近年来，研究发现在病人的外周血液中能够检测到癌细胞逸出的突变DNA，成为良好的肿瘤早期诊断、治疗预后的生物标记。Kimura等(2006年)报道能够在循环血血清中检测到EGFR突变。认为检测这些外周血液中的突变DNA，可以知道靶向药物靶标位点的分子学特征，从而判断哪个药物对病人最有效。但是，外周血液中癌细胞的突变DNA是存在于大量野生型基因背景下的极为稀少的突变基因，其存在比率一般小于0.2％，即便是手术切除的肺癌组织中也混杂了大量的正常细胞，而且并不是所有的肿瘤细胞都带有突变。上述方法不能满足越来越多的无创的突变检测需要，因此能否准确无创地检测这类稀有突变对现有检测技术提出了挑战。

发明内容

为了克服现有技术检测能力有限，现提供一种检测人类表皮生长因子受体EGFR基因29种突变的荧光PCR方法。